Os dados apresentados neste estudo mostram os efeitos dramáticos da obstrução ureteral unilateral sobre a função renal, inflamação e fibrose. Ajuda-nos a compreender os mecanismos fisiopatológicos da obstrução ureteral unilateral. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de estudar as interações célula-célula, eventos subcelulares e associar estrutura e função de forma dinâmica dentro de um rim em funcionamento.
A demonstração do procedimento ureteral será feita pela Dra. Silvia Campos-Bilderback, que é cirurgiã em nosso laboratório. Para começar, anestesiar o rato, em seguida, fazer uma incisão ao longo da linha média e localizar o rim esquerdo para separá-lo dos órgãos peritoneais circundantes. Depois de localizar o pedículo renal, compreendendo a artéria renal, a veia renal e o ureter, separe o ureter sem danificar a estrutura delicada.
Use fórceps para enrolar e amarrar uma sutura 3-0 ao redor do ureter, em seguida, amarre um nó alguns milímetros em ambos os lados do primeiro nó para garantir a obstrução completa. Uma vez que o ureter está amarrado, feche cuidadosamente as sucessivas camadas musculares e, em seguida, feche o abdômen completamente. Feche a pele externa com grampos cirúrgicos.
Para o preparo cirúrgico, coloque o rato anestesiado com uma linha de acesso venoso de demora de lado com o flanco esquerdo raspado voltado para cima plano e reto sobre a mesa. Certifique-se de que as patas dianteiras do rato se tocam umas às outras, assim como as patas traseiras. Uma vez que o rato esteja posicionado, palpar o flanco esquerdo logo abaixo das costelas para sentir o rim e determinar a posição natural no abdômen, em seguida, desenhe uma linha usando um marcador permanente ao longo da área raspada, bissectando o centro do rim em uma orientação nariz-cauda.
Use um par de pinças dentadas para agarrar e levantar a pele para cima e apertar a linha de marcador permanente com um par de hemostatos para esmagar a vasculatura subjacente e evitar sangramento. Repita o procedimento para a fina camada muscular externa para minimizar o sangramento. Para fazer a incisão final da fina camada muscular abdominal interna, palpar o rim para estimar o tamanho e a posição e levantar a camada muscular interna com um par de fórceps, em seguida, esmagar uma linha que corta a pele acima do rim com os hemostatos que é aproximadamente 1/3 do tamanho estimado do rim.
Enquanto mantém o aperto na camada muscular com a pinça, faça a incisão final. Em seguida, use fórceps em cada mão para segurar e segurar a gordura do rim no polo inferior do rim com uma técnica de mão sobre a mão trabalhando para baixo. Tendo um aperto firme na gordura com uma mão, puxe a gordura e aperte muito suavemente o rim através da incisão.
Se o rim não passar, amplie facilmente a incisão. Para identificar os glóbulos brancos ou leucócitos alojados nas alças capilares, administrar a coloração nuclear Hoechst 33342 a 8 microgramas por quilograma de peso do rato através de uma linha de acesso venoso de demora. No microscópio, coloque o rim exposto contra a borda do prato com uma ligeira rotação para que o lado abdominal do rim esteja em contato com o deslizamento da tampa e o lado dorsal esteja voltado para longe da borda.
Para minimizar ainda mais o movimento, embale duas almofadas de gaze estéreis 2 por 2 umedecidas com solução salina contra o lado dorsal do rim, reforçando o contato do lado abdominal do rim com a borda. Quando a amostra estiver posicionada, olhe através da ocular do microscópio sob iluminação de epifluorescência usando um cubo FITC de rodamina de dupla passagem. Se um movimento for detectado na posição da amostra, faça pequenos ajustes ajustando a gaze, garantindo que ela não empurre sob o rim.
Enrole o rato ligeiramente para que o tórax fique mais longe do prato. Escaneie a superfície do rim usando iluminação de epifluorescência e marque as posições dos glomérulos usando o software associado ao controlador de estágio motorizado. Para cada canal de cor sob iluminação de 2 fótons, pegue um volume 3D raso da parte superior de cada glomérulo marcado para servir como imagem de fundo.
Na opção de exibição do software de imagem, use uma pseudopaleta de cores para visualizar as intensidades fracas da fluorescência de fundo das alças capilares glomerulares. Usando um vaso sanguíneo superficial como ponto focal, infundir lentamente a albumina sérica fluorescente Texas Red RAP ou TRRSA enquanto observa o aumento e a queda da fluorescência devido à distribuição sistêmica até que uma intensidade na vasculatura peritubular e alças capilares esteja logo abaixo da saturação. Após 10 minutos, adquira volumes 3D para todos os glomérulos marcados e fotografados em intervalos de 1 micrômetro.
Encontre um vaso apropriado, seja um laço capilar ou um vaso peritubular, em seguida, gire a imagem usando a função Rotate, pois a função Line Scan no software de aquisição de imagem requer que o vaso seja perpendicular. Uma vez que a embarcação esteja girada e deitada, selecione a função XT no menu Aquisição e configure-a para digitalizar 4.000 linhas. Colocar a linha transversal ao recipiente a examinar com o plano focal no diâmetro máximo do segmento.
Em seguida, clique com o botão esquerdo do mouse na imagem composta colorida e selecione a guia Tirar instantâneo para gerar uma imagem de referência da área onde a varredura de linha foi feita. Clique imediatamente no botão Iniciar para capturar a varredura de linha da embarcação. Posteriormente, importe as varreduras de linha para o software de processamento de imagem para determinar a taxa de fluxo RBC.
No menu suspenso Medida, abra a caixa de diálogo Mostrar Estatísticas de Região e selecione a ferramenta Desenho de Linha Única para desenhar uma linha que corresponda à inclinação das sombras do RBC. Depois de observar a largura e a altura da linha, use uma equação para calcular a velocidade e, em seguida, obtenha uma média de cinco cálculos para relatar a velocidade de cada varredura de linha. Centralize um glomérulo no campo de imagem e pegue um conjunto de dados 3D começando na superfície glomerular e terminando em 30 a 35 micrômetros.
Use um tamanho de passo de 1 micrômetro na direção Z. Identifique os leucócitos comparando o canal azul de Hoechst com o canal de albumina Texas Red, procurando a exclusão de corante vermelho na alça capilar e uma mancha nuclear correspondente. Se os leucócitos parecerem estáticos em três seções ópticas, defina as células como aderidas e, em seguida, relate os valores como ocorrência por 10 seções ópticas do topo do glomérulo tomadas em intervalos de 1 micrômetro.
O número de ratos glomerulares por campo em ratos Wistar Fromter ou MWF de Munique foi aumentado no grupo UUO de 5 semanas do que em ratos não tratados. Ratos Sprague-Dawley, ou ratos SD, passaram de sem glomérulos superficiais para 2,02 por campo após cinco semanas de obstrução ureteral unilateral. Imagens tridimensionais reconstruídas foram observadas para visualizar a superfície renal.
A obstrução uretal unilateral de 5 semanas nos ratos SD não resultou em áreas semelhantes ao epitélio tubular normal, como observado no MWF, não tratado e parcialmente em ratos MWF UUO de 5 semanas. No estudo da dinâmica vascular renal, o fluxo sanguíneo renal foi significativamente reduzido nos grupos MWF UUO de 5 semanas e SD em comparação com ratos não tratados. A velocidade dos eritrócitos dentro das alças capilares glomerulares foi significativamente diminuída nos MWF UUO de 5 semanas e nos ratos SD em comparação com os ratos MWF não tratados.
Além disso, os ratos MWF não tratados tiveram menos leucócitos por 10 seções ópticas do topo, enquanto o número aumentou em ratos UUO MWF de 5 semanas e ratos UUO SD de 5 semanas. Com obstrução uretal unilateral, observou-se um aumento na permeabilidade à albumina. Um acúmulo de albumina dentro do espaço de Bowman foi intenso após obstrução uretal unilateral.
A endocitose do segmento S1 é grande quantidade de albumina, como observado com condições fisiológicas em ratos MWF não tratados. A mesma captação não pôde ser observada em ratos MWF ou SD após 5 semanas de obstrução uretal unilateral. Muitos métodos diferentes, como a repetição de imagens para estudar um processo ao longo do tempo, a fixação de uma área específica para imagens e a subsequente utilização do tecido fixo para realizar microscopia de maior resolução, podem ser feitos em conjunto com essa técnica.
A técnica é considerada tecnologia disruptiva. Ele permite que os investigadores respondam a muitas novas perguntas. Ao fazê-lo, novos insights foram fornecidos e dados de mudança de paradigma foram obtidos.
