O crescente interesse em estudar grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento desta técnica de compensação óptica que permite uma visualização tridimensional e quantificação de grandes estruturas dentro de órgãos transparentes. Este protocolo fornece uma ferramenta simples, barata, fácil de configurar e abrangente para investigar tecidos em três dimensões. A natureza multicamadas de uma doença nem sempre pode ser simulada por técnicas bidimensionais tradicionais.
A análise tridimensional do tecido pode ajudar a diagnosticar e monitorar melhor a doença. Este método não se restringe ao tecido renal e pode ser aplicado a qualquer tecido normal e doente. Este protocolo simples é fácil de seguir para qualquer cientista com alguma experiência em manejo animal.
É importante testar diferentes anticorpos em caso de rotulagem de anticorpos pobres, e realizar controles secundários de anticorpos. Comece preparando heparina contendo PBS e 3,0% paraformaldeído em 1X PBS de acordo com as instruções do manuscrito e transferindo as soluções para seringas plásticas separadas de 50 mL. Paraformaldeído é tóxico e deve ser preparado no capô da fumaça.
Coletar e profuser o rim de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, remova a cápsula e corte o rim em fatias coronais de um mm de espessura. Mergulhe as fatias renais com a solução preparada paraformaldeído em um tubo cônico de 15 mL.
Após a fixação, lave a fatia de rim duas vezes com tampão de lavagem 1X por uma hora em um roqueiro horizontal e, em seguida, proceda com a recuperação de antígeno. Aqueça 300 mL de solução de unmasking de antígeno 1X em um béquer de 500 mL. Em seguida, inclua uma fatia de rim em uma fita de incorporação permeável ao tampão aquecido e mexa-a por uma hora a 92 a 98 graus Celsius.
É importante manter a temperatura estável entre 92 e 98 graus Celsius para esta etapa de recuperação de antígenos. Em seguida, transfira a fatia em 10 mL de tampão de lavagem 1X com 0,1% Triton X-100 e arrase durante a noite. No dia seguinte, lave a fatia duas vezes com 10 mL de tampão de lavagem 1X fresco por uma hora.
Diluir o anticorpo primário em 500 microliters de anticorpos normais diluídos. Balance suavemente a fatia de rim em anticorpo primário diluído por quatro dias a 37 graus Celsius. Após a incubação, lave a fatia de rim em 10 mL de tampão de lavagem de 1X durante a noite em temperatura ambiente, alterando o buffer uma vez após oito horas.
Diluir os anticorpos secundários em 500 microliters de anticorpos normais diluídos e incubar com a fatia de rim por quatro dias a 37 graus Celsius. Por favor, note que a partir deste passo em frente, a fatia de rim deve ser protegida da luz. Após a incubação com anticorpos secundários, lave a fatia de rim em 10 mL de tampão de lavagem de 1X durante a temperatura ambiente.
Para desidratar a fatia renal, transfira-a para cinco mL de alto grau 100% etanol e abale-a por duas horas em temperatura ambiente, refrescando o etanol após uma hora. Mergulhe a fatia de rim em dois mL de cinnamate etílico e arrase suavemente durante a noite. Quando estiver pronto para a imagem do tecido, adicione 600 a 1000 microliters de cinnamate etílico em um prato de fundo de vidro e transfira a fatia de rim para o prato.
Coloque um deslizamento de cobertura redonda na fatia de rim e sele o prato com filme de parafina. Coloque o prato sobre a plataforma de imagem do microscópio e imagem do tecido de acordo com as instruções do manuscrito. Este protocolo tem sido usado para realizar com sucesso a análise 3D no tecido renal e avaliar funções e interações celulares.
O método pode causar a extinção de repórteres fluorescentes, mas outras proteínas fluorescentes fortes podem resistir à extinção do sinal. Profusão de aoórtica abdominal pode melhorar a difusão de anticorpos. Em alguns casos, a má penetração de anticorpos resulta em um sinal superficial.
Isso pode ser corrigido com maiores concentrações ou reposição de anticorpos. O parto intravascular deve ser considerado se o antígeno de interesse for expresso na vasculatura renal. No entanto, anticorpos que visam proteínas na membrana apical das células epiteliais do túbulo não cruzam a barreira de filtração glomerular e causam sinais inespecíficos.
O tecido pode ser rotulado com os anticorpos para detectar uma população celular específica ou para visualizar segmentos de túbulos inteiros. Além disso, a colocalização de proteínas em 3D pode ser alcançada combinando múltiplos anticorpos. É importante lembrar que a rotulagem de anticorpos pode ser melhorada com boa profusão renal, uso de passo de recuperação de antígeno e alta concentração de anticorpos.
Algumas proteínas fortes dos repórteres podem resistir à extinção do sinal fluorescente seguindo este protocolo. Para testar isso, pule as etapas de recuperação de antígenos e rotulagem de anticorpos. Essa técnica respeita a natureza tridimensional das estruturas e abre muitas novas áreas para a pesquisa.
Elimina as suposições e interferências necessárias associadas à análise bidimensional tradicional.
