При непосредственном нанесении инсектицида на насекомое, а не через поверхностный контакт, существует минимальное изменение воздействия инсектицидов, и это позволяет нам более точно измерять профиль восприимчивости популяций комаров. Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет рассчитывать массово-релятивизированные летальные дозы инсектицида, а не летальные концентрации, что значительно улучшает сравнение коэффициентов резистентности. Будьте осторожны, чтобы правильно хранить инсектициды, избегать загрязнения ваших инструментов и убедитесь, что части шприца находятся в хорошей форме.
Это поможет вам получить последовательные результаты. Для начала извлеките необходимые растворы инсектицидов из морозильной камеры. Немедленно вихрьте раствор или инвертируйте пять раз и поместите его в светостойкий контейнер при комнатной температуре, чтобы инсектициды нагрелись до комнатной температуры перед использованием.
Установите пять микроцентрифужных трубок с 0,5 миллилитрами ацетона каждая. Наполните ствол шприца полностью ацетоном из первой трубки. Затем выбросьте ацетон в контейнер для отходов, быстро надавив на плунжер, и повторите еще четыре раза, чтобы завершить в общей сложности пять промывок ацетона из той же ацетоновой аликвоты.
Затем заполните ствол шприца полностью воздухом и выбросьте воздух и потенциальные остатки ацетона в контейнер для отходов. Повторите еще два раза, чтобы завершить три промывки воздухом. Создайте воздушный карман внутри ствола между плунжером шприца и верхней частью иглы, подтянув плунжер примерно на пять миллиметров в ствол.
Пометьте пластиковые стаканчики случайным идентификатором для оценки смертности слепых. Используя аспиратор, приводимый в действие всасыванием от ингаляции, аспирируйте нужное количество трех-пятидневных взрослых комаров. Поместите наконечник аспиратора в трубку с хлопком, обернутым вокруг наконечника.
Осторожно выдохните и постучите по аспиратору, чтобы перенести комаров в коническую трубку. Используйте вату, чтобы заткнуть трубку, когда наконечник аспиратора удален, а затем крышкой крышки. Ненадолго сбивайте комаров в трубках, помещая их минимум на 10 минут при четырех градусах Цельсия или закапывая под лед в лоток для льда.
Перенесите сбитых комаров в палатку для обработки насекомых. Осторожно выложите комаров на пластиковый лоток, помещенный на лед, и вылейте около 50 комаров за раз, чтобы каждый из них коснулся прохладного лотка под ним и оставался сбитым с ног. Сортируйте комаров по полу, осторожно подбирая их за ноги или крылья щипцами, а затем помещая каждый пол в отдельную чашку для хранения, и останавливайтесь, когда желаемое число будет достигнуто.
Во время сортировки удалите всех комаров, которые травмированы или являются очень большими или маленькими. Чтобы записать вес чашки комара, поместите пустую чашку с чашкой Петри в качестве крышки на весы и нанесите на весы тару. Вылейте комаров в контейнер и поместите крышку сверху.
Поместите контейнер на весы и запишите окончательный вес вместе с количеством комаров. Немедленно поместите чашку образцов обратно на лед, чтобы держать их обездвиженными, пока все чашки образца не будут взвешены. Разделите подготовленных комаров на пять-10 отдельных стаканчиков, помещенных на лед, помеченных случайными идентификаторами.
Используйте пинцет и ручной счетчик, чтобы получить от 20 до 25 комаров на чашку. Чтобы отсортировать плодовых мушек, обезбольте мух с помощью углекислого газа в течение семи секунд. Вылейте мух на пакет со льдом, завернутый в скамейку.
Используя кисть с мелким наконечником, разделите и посчитайте самцов и самок. Используйте кисть, чтобы аккуратно подобрать выбранных мух, и поместите их в чистую, пустую бутылку. После выбора равного количества самцов и самок плодовых мушек, маркируйте бутылки с названием штамма и общим количеством плодовой мухи.
Обезболить бутылку плодовых мушек с помощью углекислого газа в течение семи секунд. Вылейте плодовых мушек на бумагу для взвешивания и используйте бумагу в качестве воронки, чтобы ввести мух в заостренный флакон, помеченный случайным идентификатором.Поместив крышку чашки Петри поверх флакона плодовых мушек, поместите его на весы. Запишите совокупный вес и количество образцов в оценочном листе.
Немедленно поместите флакон плодовых мушек в лоток со льдом с крышкой сверху, чтобы мухи не могли убежать. Загрузите шприц с правильной концентрацией инсектицидов, начиная с наименее концентрированной дозы и работая в направлении наиболее концентрированной дозы с каждой группой организмов. Опрокидывайте образцы на бумагу для взвешивания, помещенную поверх лотка на льду.
Отделите образцы, которые находятся близко друг к другу, используя чистую кисть без инсектицидов или ватный тампон, чтобы обеспечить легкий доступ к каждому образцу для дозирования. С помощью шприца нанесите одну каплю раствора инсектицида на вентральную грудную клетку и область брюшка для комаров и спинку для плодовых мушек. Немедленно вылейте образцы обратно в маркированный пластиковый стаканчик.
Накройте чашку сеткой и резинкой. Обратите внимание на обновленное количество образцов на чашке, если какие-либо образцы были убиты, повреждены или спасены в этом процессе. Поместите готовую чашку в лоток для хранения.
Для первой чашки запишите время, когда дозировка завершена. Повторяйте дозирование для каждой чашки до тех пор, пока все образцы не будут дозированы с надлежащими концентрациями инсектицидов, и запишите время окончания, когда все образцы были дозированы. Внесите 10% раствор сахарозы в каждую чашку с помощью влажного ватного тампона и храните комаров и плодовых мушек при желаемой температуре и влажности.
Регистрирует смертность образцов через 24 часа после начала воздействия инсектицидов. Классифицируйте комаров как живых, если они могут летать и держать себя в вертикальном положении, и мертвых, если они неподвижны или атаксические, как описано ВОЗ. Следуйте той же оценке смертности плодовых мушек.
После выполнения биоанализа были получены данные о дозовом ответе с двумя штаммами, которые являются генотипом Рокфеллера и IICC для мужского и женского Aedes aegypti. Массовая релятивизированная средняя смертельная доза для Рокфеллера и IICC составила 0,008 и 0,336 нанограмма на миллиграмм соответственно. Результаты не выявили различий между кривыми дозовой реакции самок и самцов комаров в пределах каждого штамма.
Поэтому данные обоих полов были объединены для расчета средних значений смертельной дозы. Поскольку 95%-ные доверительные интервалы для медианной смертельной дозы этих двух штаммов не перекрывались, эти значения считались существенно отличающимися. Кроме того, при расчете коэффициентов резистентности штамм IICC был более чем в 40 раз более устойчивым, чем восприимчивый штамм Рокфеллера.
Также были получены данные о реакции на дозу для плодовой мухи, Drosophila melanogaster, штамма Canton-S, и было обнаружено, что массовая релятивизированная средняя смертельная доза составляет 0,213 нанограмма на миллиграмм. Последовательность имеет решающее значение, особенно при хранении и применении инсектицида и оценке смертности. Кроме того, будьте осторожны при обращении с образцом, чтобы избежать вреда или смерти, не вызванной инсектицидом.
С помощью этого метода мы теперь можем точно определить техническую устойчивость популяции комаров и то, как условия окружающей среды влияют на устойчивость или как техническая устойчивость предсказывает практическую устойчивость.
