ICO, ou ICO-seq é a primeira adaptação do sequenciamento de RNA de alto rendimento para micróbios. Este método avaliou a função microbiana em uma escala genoma. Para micróbios projetados, este método pode elucidar como mudanças no genoma microbiano podem perturbado suas funções.
Obtenha levedura de uma cultura de suspensão, e conte as células usando um hemócito. Suspenda as células da PBS a uma concentração de cerca de 750.000 células por mililitro. Em seguida, misture o ponto de fusão ultra-baixo na PBS, e aqueça a mistura a 90 graus Celsius, até que a agarose derreta.
Carregue a mistura de agarose em uma seringa, com um filtro de 0,22 míces anexado. Coloque uma bomba de seringa na frente de um aquecedor espacial definido a 80 graus Celsius e coloque a seringa na bomba. Encha uma segunda seringa com a suspensão da levedura e encha uma terceira seringa com óleo fluorado, com fluorosurfactante 2% iônico.
Coloque as duas seringas nas bombas de seringa. Conecte a tubulação das seringas ao dispositivo A.Coloque um tubo cônico de 15 mililitros em um balde de gelo e guie a tubulação de saída para o tubo cônico. Defina a taxa de fluxo para cada seringa e colete aproximadamente um mililitro de emulsão no tubo cônico de 15 mililitros.
Depois de esperar cinco minutos para que a agarose no tubo seja definida, adicione um volume igual de 20% perfluoro-octanol em óleo fluorado à emulsão. Misture a emulsão e o perfluoro-octanol invertendo o tubo cônico algumas vezes. Centrifugar a emulsão quebrada a 2.000 vezes G por dois minutos.
Certifique-se de que os hidrogéis foram pelotados acima das fases de óleo e PFO. Remova as fases de óleo e PFO. Adicione dois mililitros de tampão tet(W) para suspender os hidrogéis.
Transfira a suspensão para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo novamente a 2.000 vezes G por dois minutos. Remova o supernatante e suspenda novamente os hidrogéis em tet(W)novamente.
Depois de girar os hidrogéis a 2.000 vezes G por dois minutos, suspenda os hidrogéis em dois mililitros de meio de cultura de levedura. Incubar o tubo durante a noite a 30 graus Celsius, com agitação. Cada cepa cresce a taxas diferentes.
A escolha de um tempo adequado de mídia e incubação é essencial para garantir que a levedura cresça dentro do hidrogel, mas não cresça demais, levando as células a escapar para a mídia. Primeiro, transfira os hidrogéis para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 2.000 vezes G por dois minutos.
Lave os hidrogéis duas vezes com PBS e, em seguida, uma vez no tampão de esferoplastia. Realize uma diluição de 40x de enzima spheroplasting em tampão de esferoplastação. Em seguida, adicione um mililitro da enzima diluída aos hidrogéis.
Incubar o tubo de hidrogéis a 37 graus Celsius por uma hora. A levedura tratada ficará mais transparente. Do tubo contendo a suspensão do hidrogel, retire 0,8 mililitros da suspensão da parte inferior do tubo e transfira-a para uma seringa sem tampa de um mililitro.
Coloque a seringa no suporte de seringa impresso em 3D. Centrifugar a seringa e o suporte a 2.000 vezes G por dois minutos. Antes de prosseguir, certifique-se de que os hidrogéis estejam bem embalados na parte inferior da seringa.
Coloque 240.000 contas de gota seq em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 1.000 vezes G por um minuto. Remova o supernascer e suspenda as contas em dois mililitros de tampão de levedura de 0,9x, com cloreto de sódio de 500 mililitros.
Insira uma barra de mexida e transfira a suspensão da conta para uma seringa de três mililitros. Prepare outra seringa, contendo vários mililitros de surfactante PFPE-PEG em óleo fluorado. Obtenha a seringa previamente preparada de hidrogéis embalados com leveduras.
Evacuar a cabeça do aquiesce, e tampar a seringa. Insira as três seringas, os hidrogéis, a suspensão das contas e o óleo nas bombas de seringa. Conecte as seringas através de tubos ao dispositivo B, o dispositivo de encapsulamento.
Coloque a extremidade da tubulação de saída em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Defina a taxa de fluxo para cada seringa. Colete aproximadamente 1.000 mililitros de emulsão, ou execute o dispositivo até que não haja mais hidrogéis.
Em seguida, siga o protocolo drop-seq para síntese de cDNA, preparação da biblioteca e sequenciamento. Usando um dispositivo microfluido, as células de levedura foram encapsuladas em gotículas de 160 micrômetros. Um divisor de oito vezes dividiu essas gotículas em oito gotículas de 60 micrômetros.
A incubação noturna resultou em colônias de leveduras isogênicas crescendo dentro de alguns dos hidrogéis. Antes de carregar os hidrogéis de levedura no segundo dispositivo microfluido, eles foram lavados e imersos em uma solução para digerir as paredes celulares. A digestão adequada foi verificada por microscopia, com células de levedura tratadas com morfologia mais reflexiva.
Um fluxo de contas de captura de mRNA no tampão de lise foi misturado com um fluxo de hidrogéis de levedura de embalagem fechada antes da junção de fabricação de gotas do segundo dispositivo microfluido. Na emulsão resultante, cerca de 10% das gotículas coletadas continham uma conta com uma colônia de lise. Este fluxo de trabalho de sequenciamento de colônia isogênica foi usado para analisar a resposta de comutação opaca branca dos c.albicans.
Componente principal, PC, análise e redução de dimensionalidade do TSNE indicaram concordância geral entre o conjunto de dados da amostra e um conjunto de dados de referência. A análise do TSNE revelou três aglomerados de células. Enquanto o cluster dois foi predominantemente composto por células do conjunto de dados da amostra, os clusters zero e um foram compostos por células de ambas as amostras.
Sobrepondo a expressão WH11 no tSNE indicou que o cluster provavelmente continha colônias brancas. A expressão STF2 aumentou no cluster um, consistente com os dados obtidos anteriormente. Nos clusters zero e dois, WH11 e STF2 foram significativamente regulados em comparação com o cluster um.
Micróbios andrógenos têm um potencial cada vez maior para produzir em massa biológicos para o tratamento de uma grande variedade de doenças. Após este procedimento, pode-se aplicar uma variedade de ferramentas bioinformáticas para analisar melhor os dados de sequenciamento.
