Este protocolo é significativo porque isola cepas fúngicas com alto potencial degradativo diretamente das amostras do solo para serem consideradas como candidatos para fins de bioremediação. Este protocolo é uma triagem de baixo custo para encontrar fungos com potencial de bioremediação. Além disso, dá resultados fáceis de interpretar.
Uma vez que esta técnica envolve o manuseio de microrganismos, é muito importante trabalhar na esterilidade usando um armário de fluxo laminar ou um queimador Bunsen para evitar contaminação. Para começar, prove o solo de interesse e peneira o solo usando uma malha de dois milímetros para remover quaisquer raízes e detritos vegetais. Sob um gabinete de fluxo laminar, adicione um grama do solo peneirado em um tubo estéril de 15 mililitros.
Em seguida, adicione 10 mililitros de água deionizada estéril para fazer uma diluição de 10 a menos uma. Agite o tubo horizontalmente por 30 minutos. Antes que a suspensão se instale, pegue um mililitro de 10 a menos uma diluição com uma pipeta estéril e transfira para um nove mililitro de água deionizada em branco para fazer 10 para a diluição menos dois.
Vórtice a suspensão completamente. Da mesma forma, faça uma diluição de 10 a menos três de um tubo de diluição de 10 para menos dois. Para emplacamento de diluições de solo em mídia seletiva, colete 100 microliters da diluição de 10 a menos três usando uma micropipette com um ponto estéril e transfira-o para uma placa de ágar petri húnica.
Distribua a diluição uniformemente na superfície do prato usando um espalhador de células estéril, descartável, em forma de L. Prepare de quatro a cinco desses pratos. Da mesma forma, prepare pratos de lignocelulose de um tubo de diluição de 10 a menos três.
Deixe os pratos secarem por 10 a 15 minutos antes de incubar a 25 graus Celsius no escuro por 15 dias. Verifique todas as colônias fúngicas presentes para semelhanças. Se necessário, prepare um slide a ser observado sob um microscópio leve.
Sob um gabinete de fluxo laminar ou em um queimador Bunsen, isole cada cepa fúngica escolhida removendo suavemente uma pequena parte do micélio da colônia com uma agulha de inoculação estéril. Transfira a colônia isolada para um novo ágar extrato de malte, ou MEA, prato. Transfira 20 mililitros de Bushnell Haas, ou meio BH, em frascos de vidro de 50 mililitros.
Transfira sete mililitros de água deionizada em frascos de 15 mililitros e adicione pedaços de tampa de vidro quebrada em cada frasco. Esterilize os frascos autoclavando a 121 graus Celsius por 20 minutos. Para testar o crescimento no petrolato, adicione um mililitro de petrolatum a cada frasco BH de 50 mililitros usando uma pipeta estéril sob o armário de fluxo laminar.
Mantenha alguns frascos com apenas BH como controle negativo. Remova o micélio na superfície do meio da placa MEA com a cepa fúngica escolhida usando uma agulha estéril e transfira-o para um frasco de vidro de 15 mililitros com os deslizamentos de cobertura quebrados. Agitar o frasco em um misturador de vórtice por dois minutos, permitindo que a tampa quebrada deslize para cortar o cubo da colônia fúngica, fazendo uma suspensão.
Inocular cada frasco de petrolatum com suspensão de 200 microliters. Faça duas réplicas para cada cepa fúngica. Para o controle negativo, adicione 200 microliters de suspensão fúngica no frasco contendo apenas meio BH.
Além disso, mantenha o frasco com petrolato sem qualquer inoculação fúngica para verificar se há contaminação no meio. Incubar os frascos a 25 graus Celsius no escuro e observá-los após 15 e 30 dias do inóculo. Para testar o crescimento do óleo do motor usado, transfira 500 microliters de óleo usado do motor para a placa BHA Petri e distribua o óleo uniformemente.
Em seguida, inocular a placa com tensão fúngica coletando o micélio das placas MEA. Para testar o crescimento em plásticos, transfira 200 microliters de suspensão fúngica para uma placa de 96 microwell. Faça três réplicas da combinação fúngica de plástico de tensão.
Adicione 10 miligramas de um pó plástico diferente a cada poço com a suspensão fúngica. Para o controle negativo, adicione 200 microliters de BH médio ao poço com a suspensão fúngica. Além disso, para cada pó plástico, encha um poço com 200 microlitres de solução BH e 10 miligramas de cada pó plástico para verificar se há contaminação.
Incubar as placas a 25 graus Celsius no escuro e observá-las após 15 e 30 dias. Para o teste calorimétrico de laccases qualitativos, prepare um litro de ágar de dextrose de batata, ou PDA, e autoclave por 20 minutos. Depois de autoclaving, quando o meio esfriou, mas ainda é líquido, adicione 400 microliters de guaiacol sob um capô de fluxo laminar e emplaque-o em placas de Petri.
Inocular a placa de guaiacol PDA com cepa fúngica coletando o micélio da placa MEA. Para controles negativos, prepare as placas PDA com cada cepa fúngica e uma placa com PDA e guaiacol. Incubar as placas a 25 graus Celsius no escuro e observá-las após sete dias.
Para o teste qualitativo de esterases, prepare um litro de meio Tween 80. Em seguida, coloque o meio em um agitador magnético sem aquecimento com uma barra de agitação dentro do meio. Após 10 minutos, quando tudo estiver derretido, transfira cinco mililitros do meio em frascos estéreis de 20 mililitros e autoclave.
Adicione 200 microliters de suspensão fúngica ao frasco médio esterilizado Tween 80. Para o controle negativo, adicione cinco mililitros de meio BH autoclaved em um frasco de 20 mililitros. Em seguida, adicione 200 microliters de suspensão fúngica ao frasco.
Incubar os frascos a 25 graus Celsius no escuro por 21 dias e observá-los a cada sete dias. A porcentagem de cepas fúngicas capazes de crescer em petrolatum, óleo de motor usado e pós plásticos como sua única fonte de carbono com diferentes graus de sucesso foi avaliada. A capacidade dos fungos de explorar o petrolatum foi avaliada como a diferença no crescimento das colônias entre BH controlada e contendo petrolatum.
Quase 75% das cepas testadas foram capazes de usar o petrolato como sua única fonte de carbono e 21% apresentaram crescimento máximo. O crescimento das placas contendo apenas BHA e na presença de óleo do motor também foi monitorado. Quase 90% das cepas cresceram com óleo de motor usado, com 39% mostrando crescimento máximo.
A formação de um halo acin marrom-vermelho ao redor da colônia fúngica indicou maior produção de laccases e outras enzimas ligninolíticas. Aproximadamente 60% dos fungos foram capazes de produzir laccases. Além disso, 17% das cepas produziram um intenso halo escuro ao redor da colônia no meio guaiacol.
A atividade de Esterases foi avaliada pela formação de um precipitado branco em Tween 80 médio. Quase 60% das cepas apresentaram atividade de esterases e 13% demonstraram maior formação precipitada. Este protocolo pode ser adaptado para tela para fungos capazes de degradar qualquer poluente adicionando a substância recalcitrante de interesse a um meio de cultura mínimo.
