Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tecnologia de Comunicação Neural (CNCT), um Centro de Recursos P41 financiado pelo Instituto Nacional de Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) e apoiado pelo National Institutes of Health (NIH).

1. Preparar Fixador (Veja tabela de Fixação e Buffers.) 2. Prepare Buffers de perfusão (Veja tabela de Fixação e Buffers.) 3. Prepare Aparelhos e Anestesia <ol><li> Usando a água do banho, tampão de perfusão quente a 37 ° C. Válvula de saída lugar num copo cheio com tampão. Encha uma seringa de 50 ml com tampão e anexar ao tubo fixador. Lave tubulação repetidamente, expulsando e retirada do buffer. </li><li> Limpar a linha com tampão até que todas as bolhas de ar na tubagem são eliminados. É essencial para o sucesso de um perfusão não ter bolhas de ar em qualquer das linhas. </li><li> Retire a seringa e conecte o fixador paraformaldeído 4% (temperatura ambiente) do recipiente. Para evitar bolhas de ar na extremidade da tubagem, apertar o tubo, enquanto o posicionamento do tubo para dentro do recipiente de modo que uma gota de tampão sobressai a partir da extremidade tó contacto com a superfície do fluido no interior do recipiente. </li><li> Feche o orifício de saída (extremidade da agulha). Coloque a válvula de tampão (azul) para a mesma posição que a válvula de fixador (branco). Isto irá permitir que o fluxo a partir da linha buffer apenas. </li><li> Abra a porta de saída e repita o passo A1 a A3 para preencher a linha de buffer. Depois de todas as bolhas de ar são eliminados perto da porta de saída, remover a seringa e conectar o recipiente de buffer, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na tubulação. </li><li> Sistema de teste para a capacidade de manter a pressão por bombagem do blub manómetro de borracha. Há normalmente alguma resistência, devido à compressão do ar no sistema. </li><li> Instalação das Ferramentas de cirurgia para que de fácil acesso. Encha agulha de perfusão com tampão para eliminar a possibilidade de bolhas de ar. </li><li> Antes da cirurgia, uma mistura de cetamina / xilazina (até 80 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de xilazina peso corporal) é administrado através de injecção intraperitoneal (27 agulha de calibre e uma seringa cc). Administração adicional de anestésico serão realizadas conforme necessário, durante o decurso de cada operação de manter um plano cirúrgico da anestesia. </li></ol> 4. Cirurgia de perfusão <ol><li> Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo na bandeja rasa preenchido com gelo moído. (Use o dedo pitada resposta método para determinar a profundidade da anestesia. Animal deve ser responder antes de continuar). </li><li> Faça uma incisão 5-6 cm lateral através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente separar o fígado a partir do diafragma. </li><li> Fazer uma pequena incisão no diafragma utilizando as curvas, a tesoura romba. A posição e da pressão do dedo pode auxiliar na capacidade de cortar o diafragma. </li><li> Continuar a incisão diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. </li><li> Coloque curvos, tesouras cegas longo de um lado das costelas, cuidadosamente deslocando os pulmões, e fazer uma cut através da caixa torácica até a clavícula. Fazer um corte semelhante no lado contralateral. </li><li> Elevação do esterno longe, apare cuidadosamente qualquer tecido conectando-o ao coração. Prender a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. Quando feito corretamente, o timo levanta longe do coração junto com o esterno, proporcionando uma visão clara dos principais vasos sanguíneos. </li><li> Faça uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo, com tesoura de íris. </li></ol><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol start="8"><li> Passa uma agulha de calibre 15-perfusão blunt-azeitona ou de ponta através do ventrículo corte na aorta ascendente. A ponta deve ser visível através da parede da aorta, e não deve atingir o arco aórtico onde as artérias carótida braquial e divergem. </li><li> Usar uma hemostato para prender o coração, este assegura a agulha e evita o vazamento. Se desejado, o hemostato modificado pode ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha (estes hemostats permanecer no lugar até que começa dissecção, mas são omitidos ilustrações futuros para maior clareza). </li><li> Finalmente, fazer uma incisão para o átrio direito do animal com uma tesoura de íris para criar uma grande tomada de uma possível sem danificar a aorta descendente. Neste ponto o animal está pronto para ser perfundido. </li></ol> 5. Perfusão <ol><li> Abra e anexar porta de saída para agulha de base tendo cuidado para não introduzir bolhas de ar. </li><li> Bombear a lâmpada manómetro a uma pressão de 80 mm Hg de forma rápida e uniformemente. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. Iniciar o temporizador. </li><li> Ajustar o ângulo da agulha. O ângulo da agulha é crítica para a obtenção de uma taxa de fluxo máxima (note a mudança do fluxo com ajuste do ângulo). </li><li> Mude o lustreer válvula (azul), uma vez tampão está quase terminada (200 ml). O fluido deve ser executado claro. A limpeza do fígado é um indicador de uma boa perfusão. O fígado deve ser claro neste ponto. Indique tempo para seus registros. </li><li> Tremores de fixação devem ser observados dentro de segundos, o que deve ser considerado o tempo real de fixação. Indique tempo para seus registros. </li><li> A pressão pode ser gradualmente aumentar até um máximo de 130 mm Hg 2 para manter uma taxa de fluxo constante. </li><li> Feche a válvula de saída uma vez que o fixador está quase concluído. Indique terminando o tempo para seus registros. </li><li> O rato deve ser duro nesta fase. </li><li> O paraformaldeído usado deve ser recolhido e armazenado para eliminação de acordo com os regulamentos da sua instituição. </li></ol> 6. Dissecção 4,11 <ol><li> Retire a cabeça, usando um par de tesouras. </li><li> Faça uma incisão na linha média ao longo do tegumento do pescoço até o nariz e expor ocrânio. </li><li> Aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta; remover qualquer músculo residual usando tesoura ou fórceps. </li><li> Coloque a extremidade afiada de um par de tesouras íris para o forame de um lado, cuidadosamente deslizando as tesouras ao longo da superfície interna do crânio. </li><li> Em seguida, fazer um corte estendendo-se para a extremidade distai da superfície posterior do crânio. Faça um corte idêntico ao lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo. </li><li> Deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio como a ponta viaja a partir do canto distal dorsal posterior para a extremidade distai frontal do crânio, levantando a lâmina de corte à medida que são para evitar danos para o cérebro. Repita para o lado oposto. </li><li> Usando fórceps casca da superfície dorsal do crânio para longe do cérebro. Aparar os lados do crânio usando fórceps tão bem. </li><li> Usando uma espátula, cortar os bulbos olfatórios e conectores nervosoções ao longo da superfície ventral do cérebro. </li><li> Gentilmente provocar o cérebro longe da cabeça, aparando qualquer dura que ainda liga o cérebro ao crânio com uma tesoura de íris. </li><li> Remover o cérebro e colocá-lo em um frasco de fluido contendo pelo menos fixador 10x o volume do cérebro em si. Agitar o frasco ocasionalmente. </li></ol> 7. Pós-fixação e armazenamento <ol><li> Manter o cérebro em fixador durante 24 horas a 4 ° C, agitando ocasionalmente. </li><li> Após 24 horas, lavar o cérebro com salina tamponada com fosfato, trocando os meios de comunicação 3 vezes e agitando a cada vez. </li><li> Cérebros podem então ser armazenadas em solução salina tamponada com fosfato ou HBHS com azida de sódio e mantida a 4 ° C. </li></ol> 8. Os resultados representativos Um indicador do sucesso inicial da perfusão é a compensação das extremidades, como o nariz, orelhas e patas e órgãos internos, tais como a glândula timo e fígado (IHC Mundial).Inspeção bruta do cérebro revela o vazio vaso sanguíneo do sangue (branco a aparência amarelo-claro). Este será também verdade dentro das seções de tecido destinar para a coloração e imuno-histoquímica. O indicador final do resultado da perfusão é a condição de a ultraestrutura no tecido. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Preparar Fixador: </td></tr><tr><td> Prepare estoque paraformaldeído 8% </td></tr><tr><td><ol><li> Adicionar 40 g de paraformaldeído a 500 ml dH 2 O. Aquecer a solução a 60 - 65 ° C enquanto se agita (Não exceda 65 ° C, fazendo assim que pode afectar negativamente o sucesso do procedimento imuno-histoquímica). </li><li> Para limpar a solução, reduzir o calor e adicionar 2-3 ml de 1,0 M NaOH com um conta-gotas. </li><li> Filtrar e armazenar a 4 ° C durante até 1 mês. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar 0,2 M tampão fosfato de sódio, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Para o sódio estoque de fosfato monobásico, adicionar 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O para 1 L dH 2 O. </li><li> Para o sódio estoque de fosfato dibásico de sódio, adicionar 28,4 g de Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. </li><li> Adicionar 810 ml de estoque monobásico a 190 ml de estoque dibásico. </li></ol></td></tr><tr><td> Prepare fixadora paraformaldeído 4% </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Adicionar partes iguais estoque paraformaldeído 8% para 0,2 M tampão fosfato de sódio </li><li> Nota: esta correcção está mais bem preparado fresco, não mais que 72 horas de antecedência. </li></ol></td></tr><tr><td> Prepare Perfusão e buffers de armazenamento: </td></tr><tr><td> Preparar tampão fosfato, pH 7,4 Solução Salina </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L de dH2O </li><li> 9 g de NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg de Na 2 HPO 4 </li><li> Verifique o pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES Hanks Solution (HBHS) com pH 7,4 Sódio Azida </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml de dH2O </li><li> 7,5 g de NaCl, </li><li> 0,3 g de KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g de dextrose / Glucose </li><li> 2,4 g de 10 mM de HEPES </li><li> 0,1 g de MgCl2 6 partes de dH2O </li><li> 0,05 g MgSO4 7 partes de dH2O </li><li> 0,165 g de CaCl2 2 partes de dH2O </li><li> 90 mg de NaN3 </li><li> Verifique o pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação de fixador e tampões. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; aparelho de perfusão com componentes marcados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação da perfusão do Aparelho I. Comece com a linha de fixador. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão para a seringa e através da linha. Fechar a válvula na extremidade da agulha fora. Coloque a linha fixador para a garrafa fixador sem a introdução de bolhas de ar. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figura 3. Preparação da perfusão do Aparelho II. 1. Abrir a válvula na extremidade da agulha. 2. Gire a válvula tampão (azul) para a posição para o fluxo. 3. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão com a seringa. 4. Fechar a válvula na extremidade da agulha. Coloque tubo dentro da garrafa buffer. Pressão de teste para garantir que o sistema é selado corretaly por bombeamento até o bulbo manômetro e observando o medidor. O aparelho está agora pronto para o procedimento de perfusão. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figura 4. Aparelho de perfusão em posição para entrega tampão. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusão Cirurgia I. a) Faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal. b) Fazer uma incisão no diafragma e atravessam o diafragma expor o coração. Fazer cortes paralelos em ambos os lados das costelas até a clavícula. c) fixar a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figura 6. Perfusion Cirurgia II. a) Passa a agulha de perfusão através do ventrículo corte na aorta ascendente. b) Assegurar operfusão agulha utilização um conjunto de hemostats para reprimir o coração. Um segundo conjunto de uma hemostato modificado pode também ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha para evitar fugas. Utilizando uma tesoura de íris fazer uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figura 7. Perfusion com bomba tampão a lâmpada manómetro para criar pressão na linha. Abra a válvula (1) e anexar ao cubo da agulha. É fundamental certificar-se há bolhas de ar são introduzidas. Bombear a lâmpada manómetro para uma pressão de 80 mm Hg e manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figura 8. Perfusion com fixador Uma vez tampão está quase terminada (200 ml) alternar a válvula de tampão (1) para permitir o fixador de fluxo. A pressão pode ser gradualmente aumentada até ummáximo de 130 mm Hg. <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Figura 9. I. Dissecção a) retirar a cabeça, usando um par de tesoura. b) fazer uma incisão na pele ao longo da linha média do pescoço para o nariz e expor o crânio. c) aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta. Segure a cabeça para que a grande abertura na superfície do crânio (forame magno) é acessível. Introduza cuidadosamente a ponta afiada de um par de íris tesoura para o forame magno e fazer um corte. Repita a mesma manobra para o lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo. <img alt="A Figura 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figura 10. Dissecção II. a) deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio. Levante a ponta como você está cortando para evitar danos ao cérebro. Repita a mesma paralado oposto. Use fórceps casca do crânio para longe do cérebro. b) ilustração com o crânio removido eo cérebro exposto. c) Utilização de uma espátula para cortar as lâmpadas olfactivas e conexões nervosas no local mais anterior do cérebro. Cuidadosamente orientar a ponta de espátula ao longo do lado de baixo do cérebro para cortar as ligações para a facilidade de remoção. Remover o cérebro e colocá-lo num frasco de fixador.

<ol>
	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Notas adicionais para uma cirurgia bem sucedida: <ol><li> Uma vez que o diafragma é violado, preceda rapidamente como hipóxia e hipercapnia iniciará irreversíveis mudanças fisiológicas que podem confundir a análise posterior. </li><li> Quando a agulha é inserida e fixada no lugar, a pressão residual vai empurrar o sangue para a base da agulha (flashback). Na verdade, os animais maiores podem vigorosamente expelir sangue. É crítico que o sangue, pelo menos, alcançar a base da agulha a fim de evitar a introdução de bolhas de ar que irão apresentar um obstáculo para completar a perfusão. Se o sangue não é observado na base da agulha, retire a agulha e encha novamente com tampão, anexando-a à porta de saída do equipamento de perfusão. Uma vez tampão tem sido gerido através da ponta, a agulha pode ser reinserido no coração. </li><li> A colocação apropriada da agulha no interior da aorta é crítica, ela não deve atingir tanto quanto o arco aórtico. </li><li> Se perfusões múltiplas estão a ter lugar, não é necessário to configuração a partir do início de cada vez. O usuário precisa ter o volume adequado para tanto o buffer e fixador em cada garrafa (200mls animal / solução). Os frascos podem também ser recarregados, se necessário. O aspecto mais importante a considerar é nivelar para fora da linha de perfusão que é executado a partir da configuração para o animal (válvula de saída). Após a conclusão de um perfusão, esta linha terá paraformaldeído a 4% na mesma. Remova o tubo do frasco de tampão e usar uma seringa de 50 ml com água para lavar o fixador. Assegure-se a válvula de saída é colocado num copo de recolha de resíduos para a eliminação adequada do paraformaldeído. Repita isso três vezes. Encher com tampão utilizando o mesmo método mostrado na 2,3. </li><li> Este método de fixação é altamente adaptável com a capacidade de alterar tanto tampão e fixadoras fixadores outros (tais como as utilizadas para a EM) de acordo com os requisitos da experiência. </li><li> O sistema também é freqüentemente usado para a extração de tecido vivo. Para esteum processo de simplesmente usa a entrega de apenas tampão (tampão de a garrafa, enquanto ainda ligado a todo o sistema é colocado em um balde de gelo ea garrafa fixador está configurada como vazio, mas selado). Isto assegura uma perfusão tampão frio à pressão óptima. A partir daqui, o sistema pode ser adaptado para a infusão de corantes fixável por qualquer adição do corante directamente para o tampão (se a quantidade não é um problema) ou utilizar uma seringa com uma quantidade mínima de tampão / solução de corante entre o buffer - passo fixador. </li><li> No caso de fundição vascular, a pressão passo tampão de monitorização é crucial no entanto, devido à viscosidade e solidificando natureza da solução de vazamento uma seringa 50 ml deve ser usado para a entrega directa ou um acessório descartável secundário para o aparelho (válvula de tubo, e segurando container) fez a interface com o sistema atual seja usado. Nossos laboratórios de fundição vascular precedeu a concepção e fabrico do aparelho de perfusão. Portanto, não podemos ªcomeu que as medições de pressão será uma medição precisa no local de entrega. Os números podem ter de ser ajustado para conseguir a entrega bem sucedida de fluidos viscosos. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestesia: </td></tr><tr><td> Cetamina / xilazina (mistura anestésica pode variar por laboratório / instituição) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Frasco 10 ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Cirurgia: </td></tr><tr><td> Ponta da agulha, 27 GA x 1,25 &quot; </td><td> Serviços material </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes Blunt / sem corte tesoura curva (aprox. 14,5 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Reta para íris tesoura </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard pinças </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Par de multa (zu) pinça </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pinça hemostática - grandes curvas ou retas (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 padrão pinça hemostática - em linha reta serrilhada (14 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 hemostat modificado (com calibre 15 buracos arquivado através da ponta) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 15 com agulha romba ou azeite de ponta (agulha de perfusão) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusão: </td></tr><tr><td> Sistema de hiperperfusão ou equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tamponada com fosfato, pH 7,4 salina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copo raso ou bandeja de plástico, cerca de 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gelo picado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Banho de água (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cronômetro </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml da seringa </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pari do padrão da Sharp / tesoura cega retas (~ 12 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medianas fórceps curvas ou retas (14-16 cm) ou alicates crânio remoção óssea </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Reta para íris tesoura (~ 9 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-espátula (2 duplos &quot;extremidades planas, um arredondado, uma reduzida para 1/8&quot;) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Pós-fixação e armazenamento: </td></tr><tr><td> 50 frasco de vidro ml </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml de HEPES-Tamponada Hanks Solução (HBHS) com azida de sódio (90mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

O objetivo da fixação é rápida e uniformemente preservar o tecido em um estado de vida semelhante. Embora a colocação do tecido directamente em obras fixadoras bem para pequenos pedaços de tecido, os espécimes maiores, como o cérebro intacto representar um problema para a fixação de imersão porque o fixador não atinge todas as regiões do tecido com a mesma taxa 5,7. Muitas vezes, muda em resposta a hipoxia começar antes do tecido pode ser preservada 12. A vantagem de perfusão fixador diretamente através do sistema circulatório é que a química pode rapidamente chegar a todos os cantos do organismo, utilizando a rede natural vascular. A fim de utilizar o sistema circulatório de forma mais eficaz, deve ser tomado cuidado para coincidir com as pressões fisiológicas 3. É importante notar que as pressões fisiológicas são dependentes das espécies utilizadas. Técnicas para a fixação de perfusão variam, dependendo do tecido a ser fixado e como o tecido será processado fixação seguinte. Neste vídeo, Nós descrevemos um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro para imuno-histoquímica. A principal vantagem desta técnica (vs. alimentado pela gravidade sistemas) é que o sistema circulatório é utilizado mais eficazmente.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Descrevemos aqui um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro.

Fixação de Perfusão todo animal para Roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

379.3K visualizações.  University of Michigan. Descrevemos aqui um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro.

Vídeo: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reprodução de vídeo automatizada interativo para estudos da comunicação animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Neurociência

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

A configuração de Baixo Custo para audiometria comportamental em roedores

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal&#8217;s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Cabeça de base acrílica Resina de moldagem técnica de fixação em roedores

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Cânula de implantação para a Cisterna Magna de roedores

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...