Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tecnologia de Comunicação Neural (CNCT), um Centro de Recursos P41 financiado pelo Instituto Nacional de Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) e apoiado pelo National Institutes of Health (NIH).

1. Preparar Fixador (Veja tabela de Fixação e Buffers.) 2. Prepare Buffers de perfusão (Veja tabela de Fixação e Buffers.) 3. Prepare Aparelhos e Anestesia <ol><li> Usando a água do banho, tampão de perfusão quente a 37 ° C. Válvula de saída lugar num copo cheio com tampão. Encha uma seringa de 50 ml com tampão e anexar ao tubo fixador. Lave tubulação repetidamente, expulsando e retirada do buffer. </li><li> Limpar a linha com tampão até que todas as bolhas de ar na tubagem são eliminados. É essencial para o sucesso de um perfusão não ter bolhas de ar em qualquer das linhas. </li><li> Retire a seringa e conecte o fixador paraformaldeído 4% (temperatura ambiente) do recipiente. Para evitar bolhas de ar na extremidade da tubagem, apertar o tubo, enquanto o posicionamento do tubo para dentro do recipiente de modo que uma gota de tampão sobressai a partir da extremidade tó contacto com a superfície do fluido no interior do recipiente. </li><li> Feche o orifício de saída (extremidade da agulha). Coloque a válvula de tampão (azul) para a mesma posição que a válvula de fixador (branco). Isto irá permitir que o fluxo a partir da linha buffer apenas. </li><li> Abra a porta de saída e repita o passo A1 a A3 para preencher a linha de buffer. Depois de todas as bolhas de ar são eliminados perto da porta de saída, remover a seringa e conectar o recipiente de buffer, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na tubulação. </li><li> Sistema de teste para a capacidade de manter a pressão por bombagem do blub manómetro de borracha. Há normalmente alguma resistência, devido à compressão do ar no sistema. </li><li> Instalação das Ferramentas de cirurgia para que de fácil acesso. Encha agulha de perfusão com tampão para eliminar a possibilidade de bolhas de ar. </li><li> Antes da cirurgia, uma mistura de cetamina / xilazina (até 80 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de xilazina peso corporal) é administrado através de injecção intraperitoneal (27 agulha de calibre e uma seringa cc). Administração adicional de anestésico serão realizadas conforme necessário, durante o decurso de cada operação de manter um plano cirúrgico da anestesia. </li></ol> 4. Cirurgia de perfusão <ol><li> Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo na bandeja rasa preenchido com gelo moído. (Use o dedo pitada resposta método para determinar a profundidade da anestesia. Animal deve ser responder antes de continuar). </li><li> Faça uma incisão 5-6 cm lateral através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente separar o fígado a partir do diafragma. </li><li> Fazer uma pequena incisão no diafragma utilizando as curvas, a tesoura romba. A posição e da pressão do dedo pode auxiliar na capacidade de cortar o diafragma. </li><li> Continuar a incisão diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. </li><li> Coloque curvos, tesouras cegas longo de um lado das costelas, cuidadosamente deslocando os pulmões, e fazer uma cut através da caixa torácica até a clavícula. Fazer um corte semelhante no lado contralateral. </li><li> Elevação do esterno longe, apare cuidadosamente qualquer tecido conectando-o ao coração. Prender a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. Quando feito corretamente, o timo levanta longe do coração junto com o esterno, proporcionando uma visão clara dos principais vasos sanguíneos. </li><li> Faça uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo, com tesoura de íris. </li></ol><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol start="8"><li> Passa uma agulha de calibre 15-perfusão blunt-azeitona ou de ponta através do ventrículo corte na aorta ascendente. A ponta deve ser visível através da parede da aorta, e não deve atingir o arco aórtico onde as artérias carótida braquial e divergem. </li><li> Usar uma hemostato para prender o coração, este assegura a agulha e evita o vazamento. Se desejado, o hemostato modificado pode ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha (estes hemostats permanecer no lugar até que começa dissecção, mas são omitidos ilustrações futuros para maior clareza). </li><li> Finalmente, fazer uma incisão para o átrio direito do animal com uma tesoura de íris para criar uma grande tomada de uma possível sem danificar a aorta descendente. Neste ponto o animal está pronto para ser perfundido. </li></ol> 5. Perfusão <ol><li> Abra e anexar porta de saída para agulha de base tendo cuidado para não introduzir bolhas de ar. </li><li> Bombear a lâmpada manómetro a uma pressão de 80 mm Hg de forma rápida e uniformemente. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. Iniciar o temporizador. </li><li> Ajustar o ângulo da agulha. O ângulo da agulha é crítica para a obtenção de uma taxa de fluxo máxima (note a mudança do fluxo com ajuste do ângulo). </li><li> Mude o lustreer válvula (azul), uma vez tampão está quase terminada (200 ml). O fluido deve ser executado claro. A limpeza do fígado é um indicador de uma boa perfusão. O fígado deve ser claro neste ponto. Indique tempo para seus registros. </li><li> Tremores de fixação devem ser observados dentro de segundos, o que deve ser considerado o tempo real de fixação. Indique tempo para seus registros. </li><li> A pressão pode ser gradualmente aumentar até um máximo de 130 mm Hg 2 para manter uma taxa de fluxo constante. </li><li> Feche a válvula de saída uma vez que o fixador está quase concluído. Indique terminando o tempo para seus registros. </li><li> O rato deve ser duro nesta fase. </li><li> O paraformaldeído usado deve ser recolhido e armazenado para eliminação de acordo com os regulamentos da sua instituição. </li></ol> 6. Dissecção 4,11 <ol><li> Retire a cabeça, usando um par de tesouras. </li><li> Faça uma incisão na linha média ao longo do tegumento do pescoço até o nariz e expor ocrânio. </li><li> Aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta; remover qualquer músculo residual usando tesoura ou fórceps. </li><li> Coloque a extremidade afiada de um par de tesouras íris para o forame de um lado, cuidadosamente deslizando as tesouras ao longo da superfície interna do crânio. </li><li> Em seguida, fazer um corte estendendo-se para a extremidade distai da superfície posterior do crânio. Faça um corte idêntico ao lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo. </li><li> Deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio como a ponta viaja a partir do canto distal dorsal posterior para a extremidade distai frontal do crânio, levantando a lâmina de corte à medida que são para evitar danos para o cérebro. Repita para o lado oposto. </li><li> Usando fórceps casca da superfície dorsal do crânio para longe do cérebro. Aparar os lados do crânio usando fórceps tão bem. </li><li> Usando uma espátula, cortar os bulbos olfatórios e conectores nervosoções ao longo da superfície ventral do cérebro. </li><li> Gentilmente provocar o cérebro longe da cabeça, aparando qualquer dura que ainda liga o cérebro ao crânio com uma tesoura de íris. </li><li> Remover o cérebro e colocá-lo em um frasco de fluido contendo pelo menos fixador 10x o volume do cérebro em si. Agitar o frasco ocasionalmente. </li></ol> 7. Pós-fixação e armazenamento <ol><li> Manter o cérebro em fixador durante 24 horas a 4 ° C, agitando ocasionalmente. </li><li> Após 24 horas, lavar o cérebro com salina tamponada com fosfato, trocando os meios de comunicação 3 vezes e agitando a cada vez. </li><li> Cérebros podem então ser armazenadas em solução salina tamponada com fosfato ou HBHS com azida de sódio e mantida a 4 ° C. </li></ol> 8. Os resultados representativos Um indicador do sucesso inicial da perfusão é a compensação das extremidades, como o nariz, orelhas e patas e órgãos internos, tais como a glândula timo e fígado (IHC Mundial).Inspeção bruta do cérebro revela o vazio vaso sanguíneo do sangue (branco a aparência amarelo-claro). Este será também verdade dentro das seções de tecido destinar para a coloração e imuno-histoquímica. O indicador final do resultado da perfusão é a condição de a ultraestrutura no tecido. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Preparar Fixador: </td></tr><tr><td> Prepare estoque paraformaldeído 8% </td></tr><tr><td><ol><li> Adicionar 40 g de paraformaldeído a 500 ml dH 2 O. Aquecer a solução a 60 - 65 ° C enquanto se agita (Não exceda 65 ° C, fazendo assim que pode afectar negativamente o sucesso do procedimento imuno-histoquímica). </li><li> Para limpar a solução, reduzir o calor e adicionar 2-3 ml de 1,0 M NaOH com um conta-gotas. </li><li> Filtrar e armazenar a 4 ° C durante até 1 mês. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparar 0,2 M tampão fosfato de sódio, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Para o sódio estoque de fosfato monobásico, adicionar 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O para 1 L dH 2 O. </li><li> Para o sódio estoque de fosfato dibásico de sódio, adicionar 28,4 g de Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. </li><li> Adicionar 810 ml de estoque monobásico a 190 ml de estoque dibásico. </li></ol></td></tr><tr><td> Prepare fixadora paraformaldeído 4% </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Adicionar partes iguais estoque paraformaldeído 8% para 0,2 M tampão fosfato de sódio </li><li> Nota: esta correcção está mais bem preparado fresco, não mais que 72 horas de antecedência. </li></ol></td></tr><tr><td> Prepare Perfusão e buffers de armazenamento: </td></tr><tr><td> Preparar tampão fosfato, pH 7,4 Solução Salina </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L de dH2O </li><li> 9 g de NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg de Na 2 HPO 4 </li><li> Verifique o pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES Hanks Solution (HBHS) com pH 7,4 Sódio Azida </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml de dH2O </li><li> 7,5 g de NaCl, </li><li> 0,3 g de KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g de dextrose / Glucose </li><li> 2,4 g de 10 mM de HEPES </li><li> 0,1 g de MgCl2 6 partes de dH2O </li><li> 0,05 g MgSO4 7 partes de dH2O </li><li> 0,165 g de CaCl2 2 partes de dH2O </li><li> 90 mg de NaN3 </li><li> Verifique o pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação de fixador e tampões. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; aparelho de perfusão com componentes marcados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação da perfusão do Aparelho I. Comece com a linha de fixador. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão para a seringa e através da linha. Fechar a válvula na extremidade da agulha fora. Coloque a linha fixador para a garrafa fixador sem a introdução de bolhas de ar. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figura 3. Preparação da perfusão do Aparelho II. 1. Abrir a válvula na extremidade da agulha. 2. Gire a válvula tampão (azul) para a posição para o fluxo. 3. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão com a seringa. 4. Fechar a válvula na extremidade da agulha. Coloque tubo dentro da garrafa buffer. Pressão de teste para garantir que o sistema é selado corretaly por bombeamento até o bulbo manômetro e observando o medidor. O aparelho está agora pronto para o procedimento de perfusão. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figura 4. Aparelho de perfusão em posição para entrega tampão. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusão Cirurgia I. a) Faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal. b) Fazer uma incisão no diafragma e atravessam o diafragma expor o coração. Fazer cortes paralelos em ambos os lados das costelas até a clavícula. c) fixar a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figura 6. Perfusion Cirurgia II. a) Passa a agulha de perfusão através do ventrículo corte na aorta ascendente. b) Assegurar operfusão agulha utilização um conjunto de hemostats para reprimir o coração. Um segundo conjunto de uma hemostato modificado pode também ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha para evitar fugas. Utilizando uma tesoura de íris fazer uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figura 7. Perfusion com bomba tampão a lâmpada manómetro para criar pressão na linha. Abra a válvula (1) e anexar ao cubo da agulha. É fundamental certificar-se há bolhas de ar são introduzidas. Bombear a lâmpada manómetro para uma pressão de 80 mm Hg e manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figura 8. Perfusion com fixador Uma vez tampão está quase terminada (200 ml) alternar a válvula de tampão (1) para permitir o fixador de fluxo. A pressão pode ser gradualmente aumentada até ummáximo de 130 mm Hg. <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Figura 9. I. Dissecção a) retirar a cabeça, usando um par de tesoura. b) fazer uma incisão na pele ao longo da linha média do pescoço para o nariz e expor o crânio. c) aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta. Segure a cabeça para que a grande abertura na superfície do crânio (forame magno) é acessível. Introduza cuidadosamente a ponta afiada de um par de íris tesoura para o forame magno e fazer um corte. Repita a mesma manobra para o lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo. <img alt="A Figura 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figura 10. Dissecção II. a) deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio. Levante a ponta como você está cortando para evitar danos ao cérebro. Repita a mesma paralado oposto. Use fórceps casca do crânio para longe do cérebro. b) ilustração com o crânio removido eo cérebro exposto. c) Utilização de uma espátula para cortar as lâmpadas olfactivas e conexões nervosas no local mais anterior do cérebro. Cuidadosamente orientar a ponta de espátula ao longo do lado de baixo do cérebro para cortar as ligações para a facilidade de remoção. Remover o cérebro e colocá-lo num frasco de fixador.

<ol>
	<li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections.">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li><li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats:+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion.">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li><li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li><li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain.">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li><li>Jung-Hwa, T. a. o. -. C. h. e. n. g., Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A, ., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain.">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li><li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li><li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+fine+structure,+and+immunostaining+for+neuropeptides:+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus.">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry.">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li><li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues.">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li><li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vertebrate dissection. , (1980).</li><li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Neurotrauma.">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Notas adicionais para uma cirurgia bem sucedida: <ol><li> Uma vez que o diafragma é violado, preceda rapidamente como hipóxia e hipercapnia iniciará irreversíveis mudanças fisiológicas que podem confundir a análise posterior. </li><li> Quando a agulha é inserida e fixada no lugar, a pressão residual vai empurrar o sangue para a base da agulha (flashback). Na verdade, os animais maiores podem vigorosamente expelir sangue. É crítico que o sangue, pelo menos, alcançar a base da agulha a fim de evitar a introdução de bolhas de ar que irão apresentar um obstáculo para completar a perfusão. Se o sangue não é observado na base da agulha, retire a agulha e encha novamente com tampão, anexando-a à porta de saída do equipamento de perfusão. Uma vez tampão tem sido gerido através da ponta, a agulha pode ser reinserido no coração. </li><li> A colocação apropriada da agulha no interior da aorta é crítica, ela não deve atingir tanto quanto o arco aórtico. </li><li> Se perfusões múltiplas estão a ter lugar, não é necessário to configuração a partir do início de cada vez. O usuário precisa ter o volume adequado para tanto o buffer e fixador em cada garrafa (200mls animal / solução). Os frascos podem também ser recarregados, se necessário. O aspecto mais importante a considerar é nivelar para fora da linha de perfusão que é executado a partir da configuração para o animal (válvula de saída). Após a conclusão de um perfusão, esta linha terá paraformaldeído a 4% na mesma. Remova o tubo do frasco de tampão e usar uma seringa de 50 ml com água para lavar o fixador. Assegure-se a válvula de saída é colocado num copo de recolha de resíduos para a eliminação adequada do paraformaldeído. Repita isso três vezes. Encher com tampão utilizando o mesmo método mostrado na 2,3. </li><li> Este método de fixação é altamente adaptável com a capacidade de alterar tanto tampão e fixadoras fixadores outros (tais como as utilizadas para a EM) de acordo com os requisitos da experiência. </li><li> O sistema também é freqüentemente usado para a extração de tecido vivo. Para esteum processo de simplesmente usa a entrega de apenas tampão (tampão de a garrafa, enquanto ainda ligado a todo o sistema é colocado em um balde de gelo ea garrafa fixador está configurada como vazio, mas selado). Isto assegura uma perfusão tampão frio à pressão óptima. A partir daqui, o sistema pode ser adaptado para a infusão de corantes fixável por qualquer adição do corante directamente para o tampão (se a quantidade não é um problema) ou utilizar uma seringa com uma quantidade mínima de tampão / solução de corante entre o buffer - passo fixador. </li><li> No caso de fundição vascular, a pressão passo tampão de monitorização é crucial no entanto, devido à viscosidade e solidificando natureza da solução de vazamento uma seringa 50 ml deve ser usado para a entrega directa ou um acessório descartável secundário para o aparelho (válvula de tubo, e segurando container) fez a interface com o sistema atual seja usado. Nossos laboratórios de fundição vascular precedeu a concepção e fabrico do aparelho de perfusão. Portanto, não podemos ªcomeu que as medições de pressão será uma medição precisa no local de entrega. Os números podem ter de ser ajustado para conseguir a entrega bem sucedida de fluidos viscosos. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestesia: </td></tr><tr><td> Cetamina / xilazina (mistura anestésica pode variar por laboratório / instituição) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Frasco 10 ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Cirurgia: </td></tr><tr><td> Ponta da agulha, 27 GA x 1,25 &quot; </td><td> Serviços material </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes Blunt / sem corte tesoura curva (aprox. 14,5 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Reta para íris tesoura </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard pinças </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Par de multa (zu) pinça </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pinça hemostática - grandes curvas ou retas (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 padrão pinça hemostática - em linha reta serrilhada (14 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 hemostat modificado (com calibre 15 buracos arquivado através da ponta) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 15 com agulha romba ou azeite de ponta (agulha de perfusão) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusão: </td></tr><tr><td> Sistema de hiperperfusão ou equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tamponada com fosfato, pH 7,4 salina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copo raso ou bandeja de plástico, cerca de 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gelo picado </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Banho de água (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cronômetro </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml da seringa </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pari do padrão da Sharp / tesoura cega retas (~ 12 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medianas fórceps curvas ou retas (14-16 cm) ou alicates crânio remoção óssea </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Reta para íris tesoura (~ 9 cm) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-espátula (2 duplos &quot;extremidades planas, um arredondado, uma reduzida para 1/8&quot;) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Pós-fixação e armazenamento: </td></tr><tr><td> 50 frasco de vidro ml </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml de HEPES-Tamponada Hanks Solução (HBHS) com azida de sódio (90mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

O objetivo da fixação é rápida e uniformemente preservar o tecido em um estado de vida semelhante. Embora a colocação do tecido directamente em obras fixadoras bem para pequenos pedaços de tecido, os espécimes maiores, como o cérebro intacto representar um problema para a fixação de imersão porque o fixador não atinge todas as regiões do tecido com a mesma taxa 5,7. Muitas vezes, muda em resposta a hipoxia começar antes do tecido pode ser preservada 12. A vantagem de perfusão fixador diretamente através do sistema circulatório é que a química pode rapidamente chegar a todos os cantos do organismo, utilizando a rede natural vascular. A fim de utilizar o sistema circulatório de forma mais eficaz, deve ser tomado cuidado para coincidir com as pressões fisiológicas 3. É importante notar que as pressões fisiológicas são dependentes das espécies utilizadas. Técnicas para a fixação de perfusão variam, dependendo do tecido a ser fixado e como o tecido será processado fixação seguinte. Neste vídeo, Nós descrevemos um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro para imuno-histoquímica. A principal vantagem desta técnica (vs. alimentado pela gravidade sistemas) é que o sistema circulatório é utilizado mais eficazmente.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Descrevemos aqui um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro.

Fixação de Perfusão todo animal para Roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

381.4K visualizações.  University of Michigan. Descrevemos aqui um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro.

Vídeo: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-oclusão do vaso / hipotensão: um modelo de rato de isquemia cerebral

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Medicina

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Neurociência

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Um método de Micro-CT-baseado para caracterizar as lesões e localização de eletrodos nos cérebros de animais pequenos

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small size of mouse organs, ex vivo perfusion of bone, bladder, skin, prostate, and reproductive organs is challenging or not feasible. Here, we report for the first time an in situ lower body perfusion circuit in mice that includes the above tissues, but bypasses the main clearance organs (kidney, liver, and spleen). The circuit is established by cannulating the abdominal aorta and inferior vena cava above the iliac artery and vein and cauterizing peripheral blood vessels. Perfusion is performed via a peristaltic pump with perfusate flow maintained for up to 2 h. In situ staining with fluorescent lectin and Hoechst solution confirmed that the microvasculature was successfully perfused. This mouse model can be a very useful tool for studying pathological processes as well as mechanisms of drug delivery, migration/metastasis of circulating tumor cells into/from the tumor, and interactions of immune system with perfused organs and tissues.

A protocol is described for in situ perfusion of the mouse lower body, including the bladder, the prostate, sex organs, bone, muscle and foot skin.

Estabelecendo in Situ Circuito Fechado Perfusão de Órgãos Abdominais Inferiores e Membros Traseiros em Camundongos

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To maintain the morphology of these delicate tissues, it is routine to administer a chemical fixative such as paraformaldehyde via cannulation of the heart in anesthetized animals (transcardial perfusion). Transcardial perfusion of the mouse heart has traditionally relied on the use of peristaltic pumps or air pressure to deliver both the saline and fixative solutions necessary for this process. As an easily accessible alternative to these methods, this work demonstrates the use of a gravity-fed method of perfusate delivery that uses materials available in most hardware stores. 
To validate this new perfusion method, this work demonstrates all the subsequent steps necessary for the sensitive detection of phosphorylated &#945;-synuclein in both the brain and spinal cord. Included in these steps are the dissection of the fixed brain and spinal cord tissues, rapid freezing/embedding and cryosectioning of the tissues, and immunofluorescent staining. As this method results in whole-body delivery of the fixative, it may also be used to prepare other non-neuronal tissues for histologic analysis.

A convenient gravity-fed perfusion method for histological analysis of the mouse central nervous system is presented. Immunofluorescent detection of phosphorylated &#945;-synuclein is demonstrated in a mouse model of Parkinson's disease. This work also comprehensively describes the transcardial perfusion, dissection, tissue freezing/embedding, and frozen sectioning steps.

Um método de perfusão transcárvia alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para Análise da Coluna Dendrítica Usando Neurolucida 360

Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed on dendritic spines. Dendritic spines are structures of great interest in research centered around synaptic plasticity, neurodevelopment, and neurological and psychiatric disorders. Dendritic spines undergo structural modifications during their lifespan, with properties such as total spine number, dendritic spine size, and morphologically defined subtype altering in response to different processes. Delineating the molecular mechanisms regulating these structural alterations of dendritic spines relies on morphological measurement. This mandates accurate and reproducible dendritic spine analysis to provide experimental evidence. The present study outlines a detailed protocol for dendritic spine quantification and classification using Neurolucida 360 (automatic three-dimensional neuron reconstruction software). This protocol allows for the determination of key dendritic spine properties such as total spine density, spine head volume, and classification into spine subtypes thus enabling effective analysis of dendritic spine structural phenotypes.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Otimizando a análise da coluna dendrítica para avaliação manual e automatizada balanceada nos dendritos apicais do hipocampo CA1

Dendritic spines are post-synaptic compartments of most excitatory synapses. Alterations to dendritic spine morphology occur during neurodevelopment, aging, learning, and many neurological and psychiatric disorders, underscoring the importance of reliable dendritic spine analysis. This protocol describes quantifying dendritic spine morphology accurately and reproducibly using automatic three-dimensional neuron reconstruction software.

Quantificação da coluna dendrítica usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed ...