Este método adquire fatias vivas do tronco auditivo do frango que engloba um gradiente maior da região de frequência na mesma fatia. Estas fatias são adequadas para experimentos eletrofisiológicos e anatômicos com um eixo tonotópico maior. Essa metodologia ajudará a entender o desenvolvimento de microcircuitos no tronco cerebral auditivo.
Enquanto a anatomia é específica para o frango, outras espécies aviárias como codornas e pássaros têm anatomia semelhante. Para começar, esterilize os ovos com 70% de etanol e incuba-os a 38 graus Celsius e 50% de umidade. Em seguida, defina a taxa de borbulha para o ACSF de tal forma que o pH seja de 7,2 a 7,4 com uma osmolalidade entre 300 e 310 miliósmolares por litro.
Em seguida, misture cinco gramas de agarose em 100 mililitros de dACSF. Dissolva a ágarose completamente usando um banho de água ou micro-ondas até que a agarose comece a borbulhar. Despeje a agarose derretida em uma placa de Petri até uma espessura de cinco milímetros e mantenha em temperatura ambiente para definir.
Após a configuração, sele a placa de Petri e armazene a quatro graus Celsius. Corte a agarose em blocos cúbicos para uso no momento da dissecação. Primeiro, limpe a área de dissecção usando 70% de etanol.
Cole o suporte ou o bloco de agarose em ângulo na bandeja vibratome. Coloque o ovo sob uma luz brilhante e localize o espaço cheio de ar no lado maior ou redondo do ovo, em seguida, quebre a casca sobre o espaço cheio de ar e exponha o saco de membrana. Faça uma incisão suave no saco para expor o bico.
Com um bisturi, puxe suavemente o pescoço e a cabeça para fora do ovo. Após a decapitação, limpe a cabeça com dACSF refrigerado. Mantenha a cabeça firme em dACSF refrigerado e faça uma incisão rostrocaudal.
Inicie a incisão atrás e entre os olhos e siga o comprimento do pescoço colhido. Separe a pele para expor o crânio. Corte o crânio atrás do olho na linha média para a direção lateral.
Repita para ambos os hemisférios. Corte a parte rostral do crânio colocando a lâmina atrás dos olhos e fazendo um corte rápido. Em seguida, mergulhe a cabeça em um prato de dACSF refrigerado.
Usando um par de tesouras pequenas, faça linha média para incisões laterais na região caudal do crânio para separar o cérebro sem causar danos teciduais. Exponha suavemente o tronco cerebral e o cerebelo. Retraia a área dorsal de todo o crânio.
Remova o tronco cerebral e exponha-o por uma escovação leve usando uma escova de tinta fina. Use fórceps curvos para limpar o tronco cerebral da conexão de tecidos e vasos sanguíneos. Separe o tronco cerebral do cerebelo cortando os peduncles e removendo os vasos sanguíneos cuidadosamente.
Corte o tronco cerebral de vasos sanguíneos adicionais. Primeiro, coloque a lâmina vibratome ao longo do eixo horizontal. Para fatias coronais, cole o tronco cerebral em uma bandeja de corte pelo lado rostral, mantendo o eixo rostrocaudal vertical.
Para fatias sagiais, mantenha o eixo medial lateral vertical. Para fatias horizontais, cole o lado ventral mantendo o eixo ventral dorsal vertical. Para alcançar o plano horizontal sagital angular agudo, cole o lado ventral do tronco cerebral de tal forma que o eixo dorsal ventral seja vertical no bloco de agarose da superfície hipotenusa.
Cole a superfície oposta do bloco de agarose de frente para a bandeja de corte e mantenha o eixo rostrocaudal paralelo à borda da lâmina. Como alternativa ao corte de vibratome, mergulhe o tronco cerebral isolado em 4% de baixo ponto de fusão agarose a 40 graus Celsius em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Depois que a agarose solidificar, corte o bloco de agarose do cubículo usando uma lâmina afiada.
Cole o bloco de agarose em seu lado rostral mantendo o eixo rostrocaudal do tronco cerebral vertical. Tome fatias coronais até que a região NM seja vista. Remova o bloco de agarose da cola com uma lâmina afiada.
Com uma agulha fina, coloque suavemente 0,5 microliters de corante azul toluidina no NM para detectar os núcleos. Remonte este bloco na bandeja de corte para fatias sagitas ou horizontais. Identifique os núcleos em relação à região manchada e se sectionia o tronco cerebral.
Após a secção, coloque as fatias de 200 a 300 mícrons coletadas sequencialmente em uma câmara fatiada contendo ACSF para equilibrar por uma hora à temperatura ambiente. Seções coronais de tecido cerebral de um embrião de frango E19 a 21 representam as regiões relativas de isofrequência dos núcleos de tronco cerebral auditivos da região auditiva mais baixa à mais alta característica. As diferentes fibras nervosas auditivas e a bifurcação dos axônios NM eram visíveis.
Também foi observado o núcleo angularis. Nas seções rostrais, o núcleo olivary superior está localizado ao longo da região lateral ventral da fatia coronal. Nas seções sagitais, foram identificados NM e núcleo laminaris ou NL onde as fibras nervosas auditivas entraram no aglomerado de neurônios.
O núcleo olivary superior foi identificado na região rostrolateral. Foram vistas regiões auditivas de baixa e alta frequência características de NM e NL ao longo do eixo rostrocaudal. A fatia mais medial mostrou os tufos axonal ipsilaterais e contralaterais e o ponto final da região auditiva.
Nas fatias horizontais, NM e NL foram identificados em direção à linha média, e os neurônios foram espalhados ao longo do eixo medial lateral. Fatias do tecido do tronco cerebral em um ângulo agudo de um plano horizontal mostraram os núcleos auditivos do tronco cerebral através de uma grande propagação diagonal. Imagens ampliadas mostraram o eixo tonotópico dos núcleos auditivos ao longo do rostromedial ao eixo caudolateral.
Certifique-se de que todo o processo seja realizado em dACSF refrigerado ao gelo continuamente borbulhado com oxigênio carb. Este protocolo é usado para pesquisadores que investigam a propriedade anatômica e biofísica do desenvolvimento de microcircuitos do tronco cerebral, especificamente a relação entre os principais núcleos auditivos.
