Idade, infecção e drogas ototóxicas podem causar degeneração das células ciliadas do ouvido interno, o que em nós leva à perda auditiva. Em vertebrados não mamíferos, como pintinhos, as células ciliadas podem ser regeneradas. As técnicas aqui descritas fazem uso do custo-benefício do trabalho com embriões de pintinhos, da facilidade de obtenção de embriões e do bom desenvolvimento exo de explantes teciduais.
Compreender o desenvolvimento e a regeneração dos pelos do ouvido interno das aves pode fornecer informações importantes sobre a perda auditiva e as possíveis terapias, e a cultura de explante pode ser importante para avaliar os efeitos ototóxicos de várias drogas. Antes de iniciar o experimento, adquira ovos recém-postos e limpe-os com etanol a 70% para evitar a contaminação. Incubar os ovos por 3,5 a 4 dias, a 37 a 38 graus Celsius com 45% de umidade.
Após a incubação, reposicione o embrião no topo da gema, colocando um ovo de lado por cinco minutos. Em seguida, use fórceps para fazer um pequeno orifício na parte superior e na extremidade romba do ovo para uma agulha de calibre 21 passar. Usando uma seringa de cinco mililitros e uma agulha de calibre 21, remova dois mililitros da albumina de um orifício na extremidade contundente do ovo.
Cubra o orifício na extremidade contundente usando fita adesiva. Para fazer com que a janela do ovo afixe a fita transparente na parte superior da casca do ovo. Segure as agulhas da microinjeção de capilares de vidro padrão usando um puxador de pipeta vertical.
Após a tração, quebre a ponta capilar usando pinça fina para obter um diâmetro de ponta de aproximadamente 50 micrômetros com uma extremidade cônica. Para o experimento de nocaute de genes, misture os três construtos, a saber, o plasmídeo-guia, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP em uma proporção um-para-um com um micrograma de proteína SP Cas9, 30% de sacarose e corante verde 0,1% rápido, e um volume final de 10 microlitros. Ao eletroporar múltiplos plasmídeos, certifique-se de que a concentração final de DNA seja de pelo menos quatro microgramas por microlitro.
Com a ajuda de uma tesoura de arco de mola, abra cerca de uma janela de dois centímetros de comprimento e 1,5 centímetro de largura e exponha o embrião. Em seguida, use fórceps para abrir as membranas coriônicas que recobrem o embrião, permitindo o acesso ao embrião. Injete cerca de 200 nanolitros de volume de mistura de solução de DNA para preencher a vesícula ótica.
Para determinar a eficiência do RNA guia realize um ensaio de endonuclease T7. Adicione gotas salinas de 0,719% ao embrião para diminuir a resistência elétrica e evitar o superaquecimento. Em seguida, coloque o eletrodo positivo através do orifício feito no lado rombudo do ovo e manobre o eletrodo para que ele fique sob a gema.
Coloque o eletrodo negativo sobre o otocisto cheio. Para transfectar o plasmídeo para a vesícula ótica com eletroporação, use um gerador de pulso quadrado e aplique cinco pulsos de 25 volts por 100 milissegundos cada, com 50 milissegundos de intervalo. Determine as condições empiricamente com base em uma configuração de eletroporação individual.
Após a eletroporação, hidrate o embrião adicionando algumas gotas de 0,719% de solução salina. Volte a selar o ovo com fita adesiva e retorne à incubadora umidificada a 37 a 38 graus Celsius para posterior incubação. Desinfete a mesa cirúrgica, o estágio do microscópio e a área circundante usando etanol e calor a 70%, ou esterilize o equipamento de microdissecção, incluindo tesouras minimamente de arco de mola, micro cureta e dois pares de pinça fina.
Prepare as placas de dissecação, incluindo uma placa de Petri de vidro com uma base de silicone preta, uma placa de Petri de plástico de 90 milímetros e uma placa de Petri de 60 milímetros. Mantenha o PBS refrigerado ou a solução salina balanceada de Hanks, também conhecida como HBSS, pronta para dissecações. Quebre suavemente o ovo na placa de Petri de 90 milímetros.
Em seguida, identifique a orelha externa do pintinho e transfira a cabeça para uma placa de Petri de 60 milímetros cheia de PBS gelada. Em seguida, oriente o embrião com a parte superior do bico voltada para dentro e segure o bico usando uma das pinças número cinco. Retire os olhos usando o segundo fórceps número cinco.
Então, de rostral para caudal, corte ao longo do crânio ao longo de sua linha média e retire o cérebro. Adicione mais PBS gelado, ou HBSS, e localize os dois otólitos da lagena como estruturas brilhantes no final do ducto coclear e perto da linha média. Para isolar duas orelhas internas, corte entre as duas lagenas, e bem acima e abaixo da região.
Em seguida, sob iluminação oblíqua, visualize o contorno do ouvido interno e remova o tecido estranho e o vestíbulo. Transfira a cóclea isolada para uma placa de base de silicone preto com PBS gelado. Descasque a cápsula coclear cartilaginosa usando pinça número cinco para obter o ducto coclear.
Em seguida, localize a camada ondulada ou tegmento do ducto coclear e remova-a usando pinça número 55 para expor a papila basilar ou a PA. Em seguida, remova a membrana tectorial para expor as células ciliadas e as células de suporte usando pinça número 55. Para a cultura de membrana da papila basilar, pegue uma placa de cultura de tecido de seis poços e organize uma inserção de membrana de cultura por poço. Desenhe alguns meios em uma pipeta de 200 microlitros e, em seguida, aspirar o explante de papila basilar dissecado com um tampão X HBSS.
Transfira o explante para uma membrana e oriente-o de modo que a papila basilar fique voltada para cima e as células ciliadas e de suporte sejam visíveis a partir do topo. Uma vez posicionado o explante, aspirar o tampão HBSS lentamente da superfície da membrana de cultura. Neste processo, o explante se ligará à membrana de cultura.
Encha o poço da placa de seis poços adicionando 1,2 mililitros de meio de águia modificado do dulbecco, ou meio de cultura DMEM, entre a inserção da membrana e a parede do poço. Para preparar a cultura de colágeno do ducto coclear, adicione três gotas de mistura de colágeno recém-preparada em cada poço de uma placa de quatro poços e transfira o ducto coclear dissecado para cada gota de colágeno. Incube a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para curar a matriz de colágeno.
Para um tratamento de pequenas moléculas das culturas, substitua o meio de cultura por 700 microlitros de meio suplementado com o modulador farmacológico, como a penicilina, e incube as placas como demonstrado anteriormente. Substitua 50% dos meios de cultura todos os dias. Após o tempo de incubação apropriado, remova o meio de cultura e use os explantes para ensaios a jusante.
Na configuração da eletroporação, o posicionamento correto do eletrodo resultou em maior expressão de GFP na orelha interna em ambos os órgãos vestibulares, e a papila basilar auditiva confirmou a transfecção. CRISPR Cas9 mediado knockout do gene Atoh1 no ouvido interno, resultando em perda de células ciliadas. O knockout do gene Atoh1 através de uma ovo-eletroporação seguida de incubação até E10 mostrou desenvolvimento reduzido de células ciliadas em comparação com o controle plasmídico vazio.
Embora a eletroporação seja mosaico, as células eletroporadas de controle foram capazes de formar células ciliadas. Em amostras eletroporadas de gRNA Atoh1, células fluorescentes verdes positivas para proteínas nunca mostraram os marcadores de desenvolvimento de células ciliadas. A cultura de órgãos da papila basilar em matriz 3D, como colágeno e coloração com anticorpos contra antígeno de células ciliadas proporcionou a excelente preservação da morfologia tecidual por até cinco dias.
A organização das células ciliadas e das células de suporte foi mantida nessas condições de cultura. As culturas de órgãos em uma membrana podem ser mantidas por até cinco dias, mantendo a integridade do feixe capilar. Isso pode ser visto na imagem representativa pela localização da proteína de ligação da ponta, a protocaderina 15.
Para investigar o desenvolvimento do feixe de cabelo, imagens de maior resolução, como microscopia de super resolução ou microscopia eletrônica de varredura, podem fornecer mais informações. Condições estéreis devem ser mantidas durante todo o procedimento. Durante a eletroporação, certifique-se de que os embriões não sequem.
Ao titular inibidores farmacológicos, pode-se reduzir a concentração para superar qualquer letalidade. Tanto embriões quanto explantes podem ser levados para experimentos de imagem. Seja realizando microscoping de vídeo em tempo real ou microscoping eletrônico confocal de luz estática, conforme mostrado no protocolo.
Dada a facilidade e acessibilidade do uso de explantes de orelha interna de pintinhos, podemos usar o meio através de triagem de prova para identificar novas moléculas essenciais para a regeneração das células ciliadas.
