Gostaríamos de agradecer a Boast Sharon para discussões perspicazes e muitos Novitch B. para o presente tipo de anticorpos de FOXP1. Este trabalho como financiado por uma bolsa de estudo do Wellcome Trust para KCT e uma subvenção projeto do Wellcome Trust para SRP (Grant número de referência 094399/B/10/Z).

1. Faça soluções necessárias <ol><li> 1 M de tampão fosfato:. Pesar 109,4 g de Na 2 HPO 4 e 32 g de NaH 2 PO 4 H 2 0, misturar e dissolver em água a um volume total de 1 litro. </li><li> Tampão fosfato salino (PBS): Preparar tampão fosfato 0,1 M, 0,15 M NaCl. 100 ml de PBS deve ser suficiente para o processamento de lâminas a partir de 10 embriões. </li><li> Agarose: Aquecer uma solução de PBS para cerca de 70 ° C e adicionar sólida baixa temperatura de fusão agarose lentamente sob agitação contínua. Tornar a solução para uma concentração final de 4% (w / v) de agarose. Fazer um stock de 50 ml desta solução. Deixar a solução em um banho de água mantido a 48 ° C até serem necessárias. Qualquer solução de agarose não utilizada após a experiência pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas. </li><li> A solução de anticorpo de bloqueio: Adicionar soro fetal de vitelo e triton X-100 a uma Concentr definitivação de 1% (v / v) de soro fetal de vitelo, 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS. 10 ml de solução de bloco é suficiente para a imunocoloração de 5 lâminas de corte no criostato. </li><li> Fixador: Preparar 0,75 milímetros NaOH, paraformaldeído a 4% (w / v) (CUIDADO). Para preparar quantidade de calor necessária fixador de água a 70 ° C, adicionar NaOH concentrado a concentração final desejada, adicionar paraformaldeído sólido e mistura-se até dissolver. Arrefecer em gelo a 4 ° C. 10 ml desta solução é suficiente para 20 poços de fatias de embriões. </li><li> Solução de sacarose: Preparar 10 ml de uma solução de sacarose a 30% (w / v) contendo 0,1 M de tampão fosfato. 10 ml desta solução é suficiente para 10 poços de fatias de embriões. </li><li> 70% (v / v) de etanol. Diluir 70 ml de etanol absoluto com 30 ml de água. </li><li> Meio de Cultura: Prepara-se uma solução de extracto de embrião de galinha a 1%, 1% Penicilina / Estreptomicina, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoethAnol, 4% de soro de galinha, 2% de suplemento B27 e 100 ng / ml de factor de crescimento ciliaryneurotrophic (CNTF) diluídos em meio neurobasal, preparada em gelo e usados ​​no mesmo dia. 10 ml de meio de cultura é necessário para 20 poços de fatias de embriões. </li></ol> 2. Preparação embrião de galinha <ol><li> Colocar ovos fertilizados de galinhas com o lado mais comprido na horizontal de tiragem forçada incubadora a 38 ° C até que elas se desenvolvem para a fase 15 24. Isto geralmente requer cerca de 4 dias de incubação. </li><li> No segundo dia de incubação, esterilizar a casca do ovo, limpando com um lenço de papel embebido em etanol a 70%. Cuidadosamente perfure a extremidade plana da casca do ovo usando uma agulha de calibre 21 ligada a uma seringa de 5 ml e 5 ml de remover da albumina. Isso diminui o embrião para longe do reservatório de modo que o embrião não é prejudicado quando o reservatório é aberto. Retornar os ovos na incubadora e incubar durante mais 2 dias. </li><li> Usando embotado Dumont # 5 fórceps carefully perfurar a parte superior central da casca e retire cerca de 9 cm 2 de shell. Corte em torno do embrião e, cuidadosamente, retire o embrião e local em HBSS durante a dissecção. Os embriões devem ser encenadas de acordo com Hamburger e Hamilton (1992) 15. Todos os embriões devem ser utilizadas no próximo a etapa 24. Quaisquer embriões que mostram quaisquer sinais de anormalidade deve ser descartada. </li><li> Remover a membrana âmnio, cório-alantóide membrana, a cabeça, e alantóide usando dois Dumont # 5 fórceps. Eviscerar o embrião para remover todos os órgãos internos. Para fazer isso, cortou a linha média ventral do embrião com micro tesoura de dissecção, manter o embrião em torno da região do tronco rostral com um par de fórceps, pegue a parte rostral do intestino e do coração e puxe caudalmente. É importante que isto seja feito de forma limpa. Você deve ser capaz de ver o embrião somitos claramente. Cortar o embrião ao meio, transversalmente entre o buds.Now membro superior e inferior do corpo aparar torácicaparede com uma tesoura microdissecção. </li></ol> 3. Preparação Slice embrião <ol><li> Remover a solução de agarose a partir do banho de água. Cortado a 5 cm do fundo de um plástico descartável 3 ml pipeta de Pasteur. </li><li> Remova cuidadosamente o meia lombar do embrião dissecadas de duas pinças para embalar o embrião da solução de dissecção e colocar em uma placa de Petri e seco. Utilizando a pipeta de Pasteur, remover cerca de 2 ml de agarose, pipeta de aproximadamente 0,5 ml por cima do embrião e depois aspirar a fatia de embrião para a pipeta. Transferir o embrião e uma casca de agarose para molde de plástico descartável tomar cuidado para não introduzir quaisquer bolhas no agarose. Diminuir suavemente o embrião para a parte inferior da agarose no molde de plástico com a secção torácica virada para baixo. O embrião deve ser posicionado para ser linear, utilizando uma agulha de calibre 21. As fatias conterá também parte do membro em desenvolvimento e é importante que a orientação do embrião no agarose vai permitir isso. Coloque o barco no gelo para definir a agarose. Tome cuidado para que o embrião não alterar a orientação durante este período (cerca de 2 min). </li><li> A Leica VT1000S vibratome (Velocidade 3, freqüência 4, 400 m de espessura) deve ser criado com a câmara de corte cheio de HBSS e cercado por água gelada. O bloco de agarose é então preso à plataforma vibratome com supercola. O bloco de agarose é aparado com uma lâmina de barbear para deixar a peça embrião com 1-3 mm de agarose que o rodeiam. As fatias, que incluem secções de brotos de membros com uma clara apical ectodérmico rebordo são seleccionados e as fatias são então colocados em HBSS. Geralmente, há apenas 1-2 fatias apropriadas por embrião. Remover suavemente a agarose em torno das fatias de tecido usando duas agulhas. É essencial que isso seja feito cuidadosamente e com cuidado. </li></ol> 4. Embrião Fatias de cultura <ol><li> Adicionar 500 ml de solução de cultura (descrita acima) para a proteced número de poços de um 24 bem baixo placa de fixação de ultra cultura tratada tecido. Transferir as fatias cuidadosamente a partir da solução de HBSS para o poço. Em geral, tentar ter 2-3 fatias em cada poço. Colocar a placa de 24 poços na incubadora de cultura de tecido a 37 ° C com 5% de CO2 durante 24 hr. </li></ol> 5. A secção dos Fatias de imunocoloração <ol><li> Após o período de cultura, adicionar 500 ul de solução não tamponada a cada poço de fatias de embriões e deixar em gelo durante 20 min. A solução total é então removido com cuidado e três lavagens de PBS são realizadas, com 5 min de intervalo. As fatias são então deixados em solução de sacarose a 4 ° C, até que o dissipador de fatias, de cerca de 6 horas, mas pode ser deixada durante mais tempo (por exemplo durante a noite). </li><li> Remover as fatias e dab largo solução de sacarose extra e equilibrar em cerca de 1 ml de outubro de cerca de 5 min a 20 ° C. Monte cada apartamento fatia em um molde de outubro cheio de casca de plástico descartável.Após a montagem, colocar os moldes verticalmente em gelo seco para solidificar. </li><li> Montar os blocos de outubro no criostato e equilibrar os blocos a -24 ° C durante cerca de 20 min. Corte cada fatia com 15 seções montadas em milímetros Superfrost-Plus slides. As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até serem necessárias. </li></ol> 6. Imunofluorescência <ol><li> Pipetar 1-2 ml de PBS nas lâminas horizontais realizadas numa câmara humidificada com as lâminas colocadas a partir do fundo da câmara (usamos 1 ou 2 ml de pipetas de plástico fixados com fita de autoclave). Incubar as secções em PBS durante 5 min a 20 ° C para remover o excesso de outubro Remover a solução de PBS a partir do slide e adicionar 500 ml de uma solução de bloqueio ao longo das secções, incubar durante 30 min a 20 ° C. Remover a solução de bloqueio e imediatamente adicionar 500 ml de anticorpo primário diluído adicionado para as lâminas, incubar a 4 ° C por 18-22 horas. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário, e imediatamente foih as lâminas com 1 ml de PBS durante 5 min, três vezes a 20 ° C para remover o excesso de solução de anticorpo primário. Adicionar 500 ml de anticorpo secundário diluído ao longo das secções. As lâminas são, em seguida, deixada a 20 ° C durante 30 min. A solução de anticorpo secundário foi então removido e a corrediça lavadas 3 vezes 5 minutos em PBS a 20 ° C. </li><li> Seguindo estas lavagens, remover a última lavagem PBS, dab a borda da lâmina para remover o excesso de PBS, adicionar duas gotas de Vectashield nas lâminas e deite cuidadosamente uma lamela de vidro sobre as secções, evitando a formação de bolhas. Remover o excesso de Vectashield por blotting da borda das lâminas antes de imagiologia. </li></ol> 7. Imagem <ol><li> Imagem dos imunoistoquímica. Nós usamos uma Nikon Eclipse E80i microscópio de fluorescência equipado com um ER ORCA Hamammatsu câmera digital e 10 X, 20X e 40 X lentes objetivas. </li></ol>

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Nenhum dos autores concorrência de interesses ou conflitos de interesse.

O protocolo aqui descrito permite uma fatia de embriões de galinha a ser incubadas durante mais de um dia, mantendo simultaneamente os neurónios motores vivo e continua a migrar durante o período de cultura. Em elucidar as condições para manter os neurônios motores vivo, nós identificamos várias características-chave necessários. Parece que o soro de pinto até 4% é crítica para a sobrevivência de neurónios motores e a sua substituição com soro a partir de uma espécie diferente não é tolerado. Curiosamente, verificou-se que a presença de maiores concentrações de soro eram prejudiciais para as fatias em que promoveu o crescimento excessivo do tecido conduzindo a grandes distorções em forma de fatia. Mais importante ainda, a presença do factor neurotrófico ciliar também provado crítica. Mantém-se uma possibilidade distinta que as fatias podem ser capazes de ser cultivadas por períodos consideravelmente mais longos do que apenas 24 horas, talvez mesmo permitindo a visualização de entrada de aferentes sensoriais para a medula espinhal. Além disso, a culcondições tura aqui também pode ser útil para cortar culturas do tronco cerebral desenvolvimento e mesencéfalo / cerebelo. Talvez a maior vantagem potencial na utilização destas condições de cultura fatia é que eles facilitam a possibilidade de manipulação farmacológica da função da proteína, enquanto minimiza o potencial de efeitos adversos sobre o resto do embrião, tais como o coração. Um grande número de inibidores e agonistas de diferentes vias de sinalização pode ser utilizado para avaliar a migração de diferentes subtipos de neurónios espinais e, potencialmente, o seu efeito na formação de circuitos locais durante o desenvolvimento da coluna vertebral. Além disso, algumas perturbações genéticas da expressão da proteína, tais como aqueles que fazem uso de siRNAs e oligonucleótidos morfolino, sofrem do facto de que eles só podem ser introduzidas no início do desenvolvimento (devido às limitações de electroporação em procedimentos in ovo) e os efeitos duram apenas um curto período de time (tipicamente de um dia). Nossa cultura fatia é iniciada em fases posteriores e oferece a possibilidade de utilizar essa tecnologia ainda em desenvolvimento na fase de corte para ver os seus efeitos durante o período da cultura da fatia. O protocolo de cultura fatia poderia também permitir a visualização de ambos neurônio motor espinhal, assim como a migração interneurônio dorsal em tempo real através de lapso de tempo microscopia de vídeo. Isto poderia ser alcançado utilizando microscopia de contraste de fase, sob luz branca ou através da utilização de imagiologia por fluorescência. Se a última técnica foi para ser usado, em seguida, a introdução de marcadores fluorescentes é necessário. Isto poderia ser conseguido quer por introdução de corantes fluorescentes, tais como DiI DiO ou através de qualquer marcação retrógrada do membro ou a rotulagem anterógrada do ventrículo ou electroporação in ovo de construções para dirigir proteínas fluorescentes em um subconjunto de neurónios.

Durante o desenvolvimento embrionário normal, muitos tipos de células diferentes que são gerados devem migrar do seu ponto de origem até onde eles eventualmente funcionar no organismo maduro. No interior da medula espinal em desenvolvimento, as células progenitoras estão localizados na zona ventricular na linha média e gerar muitos subtipos de neurónios pós-mitóticos e células gliais, que deve migrar para integrar em circuitos neuronais funcionais necessários para o processamento sensorial e saídas do motor 1. Os neurónios motores espinais que controlam a contração dos músculos do membro ter sido extensivamente estudada e é conhecida tanto das moléculas e de mecanismos que conduzem à formação de suas subclasses diferentes. No entanto, muito pouco se sabe dos mecanismos pelos quais os neurônios motores migrar, segregar e receber entradas sinápticas. Motor identidade subtipo neurônio é adquirida durante o desenvolvimento de uma forma hierárquica. Subtipos do neurônio motor pode ser amplamente classificada into colunas distintas, divisões e piscinas que são definidas por suas projeções de axônio. Colunas de motor axônios projeto para axiais, músculos viscerais ou membro. Divisões Motor subdividir o membro projetando neurônios motores da coluna do motor lateral (LMC) em aqueles projetando para os músculos ventral ou dorsal 2. Dentro das divisões, grupos de neurônios motores denominado projeto piscinas do motor para os músculos individuais no membro 2, 3. Neurónios projectam-Limb motor é definido pela sua expressão do factor de transcrição FOXP1 4, 5, enquanto que a identidade de divisão é caracterizada pela expressão dos factores de transcrição homeodomain Islet-1 (ventralmente projectando) ou LHX-1 (dorsal projectando) 6. Com efeito, LHX-1 é necessária para a expressão das projecções apropriadas dorsais dos neurónios motor 7. Cada um desses subtipos ocupam posições distintas dentro da medula espinhal; ventral neurônios motores projetando venham a residir medial dorsal projectineurônios ng motor. Isto resulta na LMC sendo segregados em LMCmedial dita (LMCm) e (LMCl) LMClateral divisões. Organização piscina divisional e motor é adquirido em duas fases 8. Na primeira fase, a segregação da divisão é obtida por meio de uma migração de neurónios motores de uma forma característica medial para lateral. As células LMCl são gerados após as células e assim LMCm LMCl migra através da LMCm para atingir a sua posição de sedimentação final. A segunda fase leva neurónios motores dentro de uma divisão e de aglomerados os em pools de neurónios motores, presumivelmente através de uma triagem dorsal-ventral dos neurónios motores. Os membros da família da caderina-catenina dependente clássica foram mostrados como sendo crucial para ambas as fases de 8-10 organização dos neurónios motores. No entanto, como a função caderina controla o movimento da célula é mal compreendida. A aquisição de identidades colunar, de divisões e piscina requer sinais extrínsecos que o padrão intrinc expressão dos fatores de transcrição 11. Além disso, cerca de 50% de todos os neurônios motores morrem por apoptose durante o desenvolvimento normal de um processo que requer sinais extrínsecos do membro, principalmente através do apoio do motor neurotrófico sobrevivência dos neurônios. Assim, o desenvolvimento motor neuron requer um ambiente adequado para ser mantida ao longo de um timecourse relativamente longo. Por esta razão, os aspectos práticos da obtenção de culturas de fatias de medula espinal de manter a sobrevivência de neurónios motores exigem a elucidação de condições de cultura adequadas. Cultura de lâminas anteriores de embriões foram usadas para seguir o comportamento das extrinsecamente adicionado purificado populações neuronais 12-14. No entanto, as nossas condições de cultura de conhecimento que facilitam a sobrevivência neuronal in situ do motor e migração dentro do segmento em si não foram publicados. Nós modificada uma condição de cultura padrão que facilita a sobrevivência de purificado, dissociadas neurónios motores cranianos para facilitar motor desenvolvimento neurônio dentro de um sistema de cultura de embriões fatia. Nós também monitorizados o posicionamento dos neurónios motores sobreviventes e demonstram que as posições em grande parte normal do neurónio motor divisões é adquirida durante o período de cultura.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ovos </td><td> Henry Stewart Farms, Reino Unido </td><td></td><td> Os ovos fertilizados de galinha Brown Bovan Gold Farms (Henry Stewart, Reino Unido), armazenados a 14 ° C até a incubação </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 21 </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 5 ml </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> º 5 Dumont fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tesoura Dissecando </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3,5 em linha reta) </td></tr><tr><td> Embrião moldes de incorporação: descascar moldes </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> Piramidal de 22 mm a 12 mm em forma </td></tr><tr><td> Super cola </td><td></td><td></td><td> Poder Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio di-hidrogénio, mono-hidrato </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Sódio Di-hidrogénio mono </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Baixa temperatura de fusão agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de bovino fetal </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plásticos descartáveis ​​pipetas pasteur </td><td> Elkay Precision laboratório consumíveis </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml de volume </td></tr><tr><td> Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrogenocarbonato de sódio </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Extrato de embrião de galinha </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina Estreptomicina / solução </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina solução </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Sul do Grupo Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Meio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> Fator CilliaryNeurotrophic (CNTF) </td><td> R e D Systems </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Pintainho Soro </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Os anticorpos primários </td><td></td><td></td><td> foram adquiridas de Desenvolvimento Estudos Hibridoma Banco, com exceção do anti-FOXP1 anticorpos, que foram um presente tipo de Bennett Novitch da UCLA. Diluições primárias de anticorpos anti-coelho foram FOXP1 (1/32000), de ratinho anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), anti-cobaia FOXP1 (1/1000). Todos os anticorpos foram armazenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpos secundários </td><td></td><td></td><td> Donkey anti-cobaia (Cy3) (1:1000) comprado de Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-coelho (Alexa Fluor 594) (1:1000) comprado de Invitrogen Todos os anticorpos foram armazenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Corning COSTAR </td><td> 3473 </td><td> fixação ultralow placa de 24 poços </td></tr><tr><td> Outubro </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Temperatura de corte óptima </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield fluorescente meio de montagem </td></tr><tr><td> Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> SuperFrost-Plus lâminas carregadas positivamente, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Tampa de vidro </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 milímetros </td></tr><tr><td> Forçado projecto incubadora: </td><td> Lyon Electric Company </td><td></td><td> mantido úmido, garantindo sempre os níveis de água suficientes, mantida a 38 ° C </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Brite, Huntingdon, no Reino Unido </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubator </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> NuAire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscópio de fluorescência </td></tr><tr><td> Câmera Digital </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M e Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

Cultura de lâminas podem facilitar a manipulação do desenvolvimento embrionário, tanto farmacologicamente e através de manipulações genéticas. Neste sistema reduzido, os potenciais efeitos colaterais fatais devidos a aplicações farmacêuticas sistémicas podem ser superados. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento prossegue normais dentro do ambiente reduzido da fatia. Temos focado no desenvolvimento da espinal medula, em particular a de neurónios motores espinais. Nós sistematicamente variadas condições de cultivo de fatias de embrião de galinha a partir do ponto em que os neurônios motores mais coluna havia nascido. Analisamos o número e tipo de neurónios motores que sobreviveram durante o período de cultura e a posição destas neurónios motores em comparação com a in vivo. Descobrimos que tipo de soro e os factores neurotróficos foram necessárias durante o período de cultura e foram capazes de manter os neurónios motores vivo durante pelo menos 24 horas e permitir que os neurónios motores a migrar para as posições apropriadas nomedula espinal. Apresentamos estas condições de cultura e a metodologia de preparação das culturas de embriões de fatia utilizando embriões de galinha evisceradas incorporados em agarose e cortado utilizando um vibratome.

A utilização de culturas de fatias para seguir o desenvolvimento de neurónios de projecção e interneurônio foi influente em progredir a nossa compreensão da geração de organização no interior do córtex 16. Na espinal medula, neurónios motores do desenvolvimento foi seguido utilizando as culturas de embriões de peixes-zebra integrais 17. No entanto, espinal motor neuron organização no peixe-zebra é relativamente simples (devido à falta de músculos dos membros grandes em peixes). Os mecanismos moleculares que conduzem uma hierarquia de espinal organização neurónio motor durante o desenvolvimento dos vertebrados superiores são actualmente mal compreendidos. As condições de cultura que facilitam a sobrevivência neuronal e da migração das células do corpo, em culturas de embriões de fatia de vertebrados superiores estão assim requerido. Actualmente, as culturas de medula espinal de fatia de vertebrados superiores têm sido usadas para os neurónios dissociados de sementes em cima das fatias 12-14, investigar os axônios marcadas com fluorescência na periferia da fatia18, ou de comportamento de células progenitoras no desenvolvimento precoce do cordão espinal 19. Fatie condições de cultivo para cordas depois da coluna vertebral, especialmente aqueles que mantêm neurônio motor de desenvolvimento não existem actualmente. Para tentar acompanhar o desenvolvimento neuronal espinhal, particularmente a de neurônios motores espinhais, investigou várias condições de cultura que pode promover a sobrevivência do neurônio motor de e aquisição de ordem inicial na organização motora por meio da migração lateral dos neurônios. Testes iniciais utilizando fase 18 para o estágio 20 de embriões de pintos fatias de medula espinhal foram infrutíferas; que não foram capazes de manter os neurônios motores vivo por mais tempo do que algumas horas e foram incapazes de demonstrar a geração de um número significativo de células LMCl durante o período de cultura (dados não mostrados). Nós, portanto, investigado culturas fatia de estágio 24 embriões, um ponto no tempo, quando a maioria dos LMCl e neurônios LMCm foram gerados, mas quando LMCl neurônio migração ainda está em sua infancy (Figura 1a-c). Esta migração lateral de neurônios LMCl está amplamente completo por etapa 27, por volta de 24-36 horas mais tarde (Figura 1 df). O nosso ensaio pode assim ser simplificada para ser capaz de manter os neurónios vivos e para facilitar a sua migração lateralmente no corno ventral. Iniciamos nossas experiências com condições de cultura relativamente simples, contendo apenas Hank solução salina balanceada com ou sem soro frango ou extrato de embrião de galinha. Em todos os casos, mas foram capazes de manter os neurônios LMC na fatia, encontramos pouca evidência de neurônios LMCl sendo mantida (pelo menos por expressão de LHX-1). Além disso, observou-se expressão inapropriada de genes, tais como HB9 na medula espinal dorsal, uma situação que não ocorre in vivo (dados não mostrados). Assim, estas condições de cultura simples não são adequados para a investigação da aquisição da organização motora neurónio. Nós, portanto, procurou conditio mais complexons e como base utilizada uma formulação que foi publicado para facilitar a sobrevivência da dissociadas embrionárias frango neurônios motores cranianos. Esta condição 20 (extracto de embrião de pinto de 1%, 1% Pen Strep, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoetanol, 2% de soro de cavalo, 2% de suplemento B27 e 50 ng / ml de factor de crescimento ciliaryneurotrophic (CNTF) em meio neurobasal (aqui chamado Guthrie médio) manteve mais neurônios motores vivos do que os meios de comunicação mais simples. Além disso, não resultou na expressão de fatores de transcrição espúria na medula espinhal dorsal. entanto, a sobrevivência de neurônios LMCl era pobre (Figura 1 gi, p). Portanto, o que variaram considerados factores essenciais para o meio Guthrie, a saber, o animal de origem do soro, a concentração do soro e a concentração de CNTF no meio. Nós descobrimos que a mudança do soro a partir de soro de cavalo para pintainho soro e um aumento na concentração de CNTF a partir de 50 ng / ml a 100 ng / ml aumentou substancialmente tele sobrevivência das células e LMCl LMCm e permitiu também a sua migração no corno ventral em relação ao hr 24 das condições de cultura (Figura 1 jl, p). O número total de neurónios motores, a razão entre a LMCm LMCl e, de facto, a migração das células LMCl no corno ventral pareceu muito semelhante às secções de embriões que foram autorizados a desenvolver in ovo, em vez de na cultura fatia (Figura 1 ko, p). Assim, acreditamos que com base no número de células de expressão factor de transcrição, e na posição de neurónios motores, as nossas condições de cultura normais fatia recapitular o desenvolvimento motor espinal neurónio pelo menos ao longo de um período de 24 horas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figura 1. a - c. Situação da geração de LMC (FOXP1 coloração emb) e LMCl (LHX-1 coloração em a) na fase 24. c é uma fusão dos dois canais. A linha média é mostrada como uma linha tracejada e em D, V mostra a orientação do eixo (D, V) dorsoventral da medula espinhal d -. F. . Status de LMC (FOXP1 coloração em d) e LMCl (LHX-1 em coloração e) organização na fase 27 f é uma fusão dos dois canais g -. I. Lhx-1 (g) e FOXP1 (h) a expressão em secções de uma fatia cultivadas num meio que suporta cranial do motor sobrevivência celular neuronal (Guthrie meio, o nosso &quot;meio inicial&quot; ver referência 20). Lhx-1 já não é expresso em neurónios motores, embora haja alguma sobrevivência de células de LMC evidenciadas por FOXP1 expressão. D, V em (g) mostra a orientação do eixo (D, V) dorsoventral da medula espinhal. ML mostra a orientação dos eixos (M, L) mediolateral do sj cabo de Pinal - l. Células LMCl (LHX-1 no corno ventral em j) e a LMC em geral (em FOXP1 k) pode ser observada em fatias cultivadas em meio contendo 4% de soro de pinto e de 100 ng / ml de CNTF. Note-se que algumas células LMCl são encontrados numa posição lateral no corno ventral. A seta em (j) mostra a posição lateral de uma parte das células dos LMCl. (L) é uma fusão dos dois canais m -. O. Estado de expressão de LHX-1 (m) e FOXP1 (n) em secções de um embrião mantida in ovo durante a cultura do embrião fatia mostrado na j - l. (O) é uma fusão dos dois canais. P. A determinação quantitativa da percentagem de LMCl (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) contra células de LMC (FOXP1 + ve /-ve Lhx1) células encontradas na cultura de lâminas de diferentes condições compared para controlar embriões mantidos in ovo (que representam 100%). *** Teste t de Student-representa p &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.9K visualizações.  University College London. Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Vídeo: Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

Técnica Minimamente Invasiva e Rápida de Hemisecção Lateral da Medula Espinhal para Modelagem de Lesões Medulares Abertas em Ratos

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Modelo de Lesão Cerebral Traumática Leve em Camundongos com Controle Eletromagnético

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...