Este protocolo apresenta o procedimento desde a amplificação de célula única até os dados finais de relatórios no teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Este procedimento pode ajudar os espectadores a ter uma boa compreensão do fluxo de trabalho experimental do sequenciamento PGT-A e replicar essa técnica em um laboratório de diagnóstico com uma plataforma NGS baseada em semicondutores. Comece por tubos de 25 microlitadores de todo o genoma produtos de amplificação e transferindo-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro pré-carregado com 25 microliters de água livre nuclease.
Vórtice e misture as contas de purificação de DNA. Alíquota 50 microliters desta solução em cada tubo amostral. Vórtice e centrífuga brevemente por cinco segundos.
Coloque o tubo por cinco minutos em temperatura ambiente para o processo de ligação de DNA. Insira o tubo de centrífuga de 1,5 mililitro em um rack magnético. Então, espere até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo.
Transfira cuidadosamente o supernasal em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Evite estoizar as contas. De acordo com o volume original da amostra.
Pipeta 30 microliters de contas magnéticas, vórtice e centrífuga brevemente por cinco segundos. Coloque o tubo por cinco minutos em temperatura ambiente para o processo de ligação de DNA. Insira os tubos de centrifugação de 1,5 milímetros no rack magnético.
Então, espere até que todas as contas magnéticas sejam atraídas para a parede lateral do tubo. Remova cuidadosamente e descarte o supernaspe. Evite encanar as contas.
Pipeta 300 microliters de 70% de etanol no tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire suavemente o tubo duas vezes em um ângulo de 180 graus e mova as contas ao longo da parede do tubo para uma lavagem completa. Pipeta e descarte o supernaspe.
Evite encanar as contas. Repita o procedimento de lavagem uma vez. Coloque uma nova placa de amplificação no sistema assim que o programa limpo estiver concluído.
Insira os tubos de coleta, cada um pré-preenchido com 150 microliters quebrando a solução dois no rotor, em seguida, coloque a ponte sobre os tubos de coleta. Adicione o óleo de reação à metade do tubo e a solução de quebra do emulsificador a um terço do tubo. Coloque um novo filtro para a preparação do modelo em um rack de tubo com o portal de amostra posicionado para cima.
Vórtice a solução por cinco segundos e centrífuga brevemente por cinco segundos. Em seguida, transfira a solução para o portal de amostras do filtro após a pipetação de 800 microliters três vezes. Centrifugar o tubo para diminuir bolhas antes da última injeção.
Evite injetar ar no filtro. Injete 200 microliters de óleo de reação dois, seguindo a solução mista. Gire o portal de amostras do filtro para baixo e substitua a adaptação de lavagem pelo filtro.
Insira a agulha da amostra no orifício central da tampa do rotor e, em seguida, pressione a agulha até o fundo. Clique no botão Executar na tela e escolha o programa de acordo com o kit correspondente. Em seguida, selecione Assistido para verificar todas as etapas.
Clique em Next até que a execução seja iniciada. A corrida levará aproximadamente 4,5 horas para terminar. Selecione Next quando o programa terminar.
O sistema iniciará um processo de centrifugação de 10 minutos. Após a centrifugação, clique no botão Abrir tampa e mova os tubos de coleta para racks. Se o procedimento não passar para a próxima etapa em 15 minutos, pressione o giro final para re-centrífugas.
Remova o supernatante no tubo de coleta, deixando 100 microliters de solução no tubo. Misture a amostra restante por pipetação e transfira a amostra para o novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro marcado OT. Ao pipetar o supernatante, evite tocar na parte inferior do tubo ao longo dos lados. Pipeta 100 microliters de água livre de nuclease em cada tubo de coleta e transferir a solução para o tubo OT lavado por tubulação repetida.
Adicione 600 microliters de água livre de nuclease ao tubo OT para compor o volume total de um mililitro. Vórtice por 30 segundos em centrífuga a 15.500 vezes G por oito minutos. Remova suavemente o supernatante deixando 100 microliters de solução no tubo OT.
Use a ponta para descartar completamente a camada de óleo. Adicione 900 microliters de água livre de nuclease, vórtice por 30 segundos e centrífuga a 15.500 vezes G por oito minutos. Remova o supernatante até 20 microliters da solução permanece e adicione a solução de resususus pendentes do modelo para compor o volume de 100 microliters.
Em seguida, vórtice por 30 segundos e brevemente centrífuga por dois segundos. Prossiga para o próximo passo dentro de 12 horas após o processamento da amostra Carregar 100 microliters da biblioteca diluída, 130 microliters de contas C1, 300 microliters de três x solução de lavagem de modelo, e 300 microliters da solução de derretimento para as oito tiras de poço. Instale as oito tiras de poço no Módulo de Enriquecimento, carregue a ponta de pipetação e coloque o tubo de centrífugas de 200 microliters na posição de coleta.
Clique em Iniciar para executar o programa. Pipeta 55 microliters da solução amostral e injetá-la no orifício amostral do chip. Coloque o chip na centrífuga.
Mantenha o entalhe para o lado de fora e o portal de amostras dentro. Em seguida, equilibre-o com outro chip usado e centrífuga por 10 minutos. Prepare a solução de carregamento conforme descrito no manuscrito do texto.
Sopre 100 microliters de ar na solução de espuma. Pipeta a solução repetidamente até que as bolhas estejam em um estado denso, espumando e mantenha o volume de espuma para aproximadamente 250 microliters. Coloque o chip no banco após a centrífuga.
Injete 100 microliters de espuma no orifício da amostra e remova a solução extrudada no portal de saída. Em seguida, centrifugar o chip brevemente por 30 segundos. Repita este processo uma vez.
Injete 100 microliters a 50% de tampão de lavagem duas vezes e remova a solução extrudada no portal out após cada injeção. Em seguida, injete 100 microliters a 50% de corte de buffer três vezes e remova a solução extrudada no portal out após cada injeção. Injete 65 microliters no buffer de reação de 50% de enzimas, evitando bolhas e remova a solução extrudada no portal out.
Estabilize o chip carregado em temperatura ambiente por cinco minutos e instale o chip no portal do chip sequenciador. Escolha o programa planejado, verifique as informações e inicie a execução. A corrida representativa obteve um total de 17,6 gigabytes de dados e a taxa de carregamento global da partícula da esfera de íon foi de 88% no total de poços do chip.
O mapa de calor confirmou até mesmo o carregamento de amostras na área total do chip. 77% do total de leituras eram utilizáveis. Todos os poços carregados com ISP mostraram 100% de enriquecimento de modelos em que 78% eram clonais.
De todos os modelos clonais, 97% foram qualificados como biblioteca final. O comprimento médio da leitura foi de 177 pares de base, enquanto a mediana e o modo foram 176 e 174 pares de base, respectivamente. As contagens máximas de timina, citosina e adenina nos modelos foram de aproximadamente 76 sobre a linha de corte qualificada de 50.
Em todos os poços endereçados com ISPs vivos 99,5% qualificados como biblioteca construída e 20% de bibliotecas policlonais e de baixa qualidade foram filtrados, enquanto 76,6% dos ISPs foram qualificados para análise suplementar. O resultado da variação do número de cópia de uma única amostra retratou um segmento de 182,16 pares de megabases de mosaico de P 16,3 a Q 35,2 no cromossomo quatro e um segmento monossomia de 33 pontos 13 megabases de Q 11,1 a Q 13,33 no Cromossomo 22. Ao realizar a seleção de fragmentos, os intervalos de tempo entre as etapas devem ser modificados de acordo com o tamanho das amostras no mesmo lote para evitar excesso e falta de exposição para amostras frontais e traseiras.
