פרוטוקול זה מציג את ההליך מהגברה של תאים בודדים ועד לנתוני דיווח סופיים בבדיקות הגנטיות שלפני ההשרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. הליך זה יכול לעזור לצופים להבין היטב את זרימת העבודה הניסיונית של ריצוף PGT-A ולשכפל טכניקה זו במעבדת אבחון עם פלטפורמת NGS מבוססת מוליכים למחצה. התחילו בצינורות של 25 מיקרוליטרים של כל תוצרי ההגברה של הגנום והעברתם לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר הטעון מראש ב-25 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז.
מערבבים ומערבבים את חרוזי טיהור הדנ"א. Aliquot 50 microliters של פתרון זה לתוך כל צינור דגימה. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר למשך חמש שניות.
מכוונים את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לתהליך קשירת הדנ"א. הכנס את צינור הצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לתוך מתלה מגנטי. לאחר מכן, המתן עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לקיר הצדדי של הצינור.
העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. הימנעו מלהוציא את החרוזים. על פי נפח המדגם המקורי.
פיפטה 30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר במשך חמש שניות. מכוונים את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לתהליך קשירת הדנ"א. הכנס את צינורות הצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"מ לתוך המדף המגנטי.
לאחר מכן, המתן עד שכל החרוזים המגנטיים יימשכו לקיר הצדדי של הצינור. הסר בזהירות והשלך את הסופרנטנט. הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה.
פיפטה 300 מיקרוליטר של 70% אתנול לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סובבו בעדינות את הצינור פעמיים בזווית של 180 מעלות והזיזו את החרוזים לאורך דופן הצינור לשטיפה יסודית. פיפטה והשליכו את הסופרנטנט.
הימנעו מלהוציא את החרוזים החוצה. יש לחזור על הליך הכביסה פעם אחת. הניחו צלחת הגברה חדשה במערכת לאחר השלמת התוכנית הנקייה.
הכנס את צינורות האיסוף, שכל אחד מהם ממולא מראש ב -150 מיקרוליטרים שוברים את תמיסה שתיים לתוך הרוטור, ולאחר מכן הנח את הגשר על צינורות האיסוף. מוסיפים את שמן התגובה למחצית הצינור ואת תמיסת שבירת המתחלב לשליש מהצינור. מקם מסנן חדש להכנת תבנית במדף צינורות כאשר פורטל הדוגמאות ממוקם כלפי מעלה.
מערבבים את התמיסה במשך חמש שניות וצנטריפוגה לזמן קצר במשך חמש שניות. לאחר מכן להעביר את הפתרון לתוך פורטל המדגם של המסנן לאחר pipetting 800 microliters שלוש פעמים. צנטריפוגה את הצינור כדי להקטין בועות לפני ההזרקה האחרונה.
הימנעו מהזרקת אוויר למסנן. הזריקו 200 מיקרוליטרים של שמן תגובה שניים, בעקבות התמיסה המעורבת. סובב את פורטל הדגימה של המסנן כלפי מטה והחלף את התאמת הכביסה במסנן.
הכנס את מחט הדגימה לחור המרכזי של מכסה הרוטור ולאחר מכן לחץ על המחט לתחתית. לחץ על כפתור ההפעלה על המסך ובחר את התוכנית בהתאם לערכה המתאימה. לאחר מכן בחר סיוע כדי לבדוק את כל השלבים.
לחץ על הבא עד תחילת הריצה. הריצה תארך כ-4.5 שעות. בחר הבא בסיום התוכנית.
המערכת תתחיל בתהליך צנטריפוגה של 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, לחץ על הלחצן פתח מכסה והזז את צינורות האיסוף למדפים. אם ההליך אינו עובר לשלב הבא תוך 15 דקות, לחץ על הסיבוב הסופי כדי לבצע צנטריפוגה מחדש.
הסר את supernatant בצינור האיסוף, משאיר 100 microliters של תמיסה בצינור. מערבבים את הדגימה הנותרת על ידי פיפטינג ומעבירים את הדגימה לצינור הצנטריפוגה החדש של 1.5 מיליליטר המסומן OT. בעת צנרת הסופר-נטנט, הימנעו מלגעת בתחתית הצינור לאורך הצדדים. Pipette 100 microliters של מים ללא נוקלאז לתוך כל צינור איסוף ולהעביר את התמיסה לצינור OT שטף על ידי pipetting חוזר.
הוסף 600 מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז לצינור OT כדי לפצות על הנפח הכולל של מיליליטר אחד. מערבולת במשך 30 שניות בצנטריפוגה ב 15, 500 פעמים G במשך שמונה דקות. הסר בעדינות את supernatant משאיר 100 microliters של תמיסה בצינור OT.
השתמשו בקצה כדי להשליך את שכבת השמן לחלוטין. הוסף 900 מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז, מערבולת במשך 30 שניות וצנטריפוגה ב 15, 500 פעמים G במשך שמונה דקות. הסר את הסופר-נאטנט עד שיישארו 20 מיקרוליטרים של התמיסה והוסף את פתרון ההחייאה של התבנית כדי להשלים את הנפח של 100 מיקרוליטר.
לאחר מכן מערבלים במשך 30 שניות וצנטריפוגה קצרה במשך שתי שניות. המשך לשלב הבא תוך 12 שעות מעיבוד הדגימה טען 100 מיקרוליטרים של הספרייה המדוללת, 130 מיקרוליטרים של חרוזי C1, 300 מיקרוליטרים של שלושה x תמיסת שטיפת תבנית, ו -300 מיקרוליטרים של תמיסת ההמסה לשמונה רצועות הבאר. התקן את שמונה רצועות הבאר על מודול ההעשרה, טען את קצה הפיפטינג וקבע את צינור הצנטריפוגה של 200 מיקרוליטר במצב האיסוף.
לחץ על התחל כדי להפעיל את התוכנית. Pipette 55 microliters של פתרון המדגם ולהזריק אותו לתוך חור הדגימה של השבב. הגדר את השבב על הצנטריפוגה.
שמור את החריץ כלפי חוץ ואת פורטל המדגם בפנים. לאחר מכן, לאזן אותו עם שבב משומש אחר צנטריפוגה במשך 10 דקות. הכן את פתרון הטעינה כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לפוצץ 100 מיקרוליטר של אוויר לתוך פתרון מקציף. צמצמו את התמיסה שוב ושוב עד שהבועות נמצאות במצב צפוף ומקציף ושמרו על נפח הקצף לכ-250 מיקרוליטרים. מניחים את השבב על הספסל לאחר צנטריפוגה.
הזריקו 100 מיקרוליטרים של קצף לתוך חור הדגימה והסירו את התמיסה המובלטת לפורטל החוצה. לאחר מכן, צנטריפוגה השבב לזמן קצר במשך 30 שניות. חזור על תהליך זה פעם אחת.
הזריקו 100 מיקרוליטרים ב-50% שטיפה פעמיים והסירו את התמיסה המובלטת בשער החיצוני לאחר כל הזרקה. לאחר מכן הזריקו 100 מיקרוליטרים ב-50% חישול שלוש פעמים והסירו את התמיסה המובלטת בשער החיצוני לאחר כל הזרקה. להזריק 65 מיקרוליטרים במאגר תגובה של 50% אנזים, להימנע מבועות ולהסיר את התמיסה המובלטת בפורטל החוצה.
ייצב את השבב הטעון בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והתקן את השבב בפורטל שבב הרצף. בחר את התוכנית מתוכננת לבדוק את המידע ולהתחיל את ההפעלה. הריצה הייצוגית השיגה בסך הכל נתונים של 17.6 ג'יגה-בייט וקצב ההעמסה הכולל של חלקיק כדור היונים היה 88% מסך הבארות של השבב.
מפת החום אישרה אפילו טעינה לדוגמה על שטח השבב הכולל. 77% מכלל הקריאות היו שמישות. כל הבארות הטעונות בספק שירותי אינטרנט הראו 100% העשרת תבניות שבהן 78% היו קלונליות.
מתוך כל התבניות הקלוניות, 97% הוסמכו כספרייה הסופית. האורך הממוצע של הקריאה היה 177 זוגות בסיסים ואילו החציון והמצב היו 176 ו-174 זוגות בסיסים, בהתאמה. ספירות השיא של תימין, ציטוזין ואדנין בתבניות היו כ-76 מעל קו החיתוך המוסמך של 50.
בכל הבארות הניתנות להתייחסות עם ספקי שירותי אינטרנט חיים 99.5% הוסמכו כספרייה הבנויה ו-20% מהספריות הפוליקלונליות והאיכותיות היו מסוננות בעוד ש-76.6% מספקי שירותי האינטרנט היו מוסמכים לניתוח נוסף. התוצאה של שונות מספר ההעתקה מדגימה בודדת תיארה טריזומיה פסיפס של 182.16 מגה-בסיס של P 16.3 עד Q 35.2 על כרומוזום ארבע ומקטע מונוזומי של 33 נקודות 13 מגה-בסיס של Q 11.1 עד Q 13.33 על כרומוזום 22. בעת ביצוע בחירת שברים, יש לשנות את מרווחי הזמן בין השלבים בהתאם לגודל הדגימות באותה אצווה כדי למנוע חשיפת יתר וחוסר חשיפה לדגימות קדמיות ואחוריות.
