Bu protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testte tek hücreli amplifikasyondan nihai raporlama verilerine kadar prosedürü sunar. Bu prosedür, izleyicilerin PGT-A diziliminin deneysel iş akışını iyi anlamalarına ve bu tekniği yarı iletken tabanlı bir NGS platformuna sahip bir teşhis laboratuvarında çoğaltmalarına yardımcı olabilir. Tüm genom amplifikasyon ürünlerinin 25 mikrolitresini pipetleyerek, bunları 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile önceden yüklenmiş 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak başlayın.
Vorteks ve DNA saflaştırma boncuklarını karıştırın. Aliquot Bu çözeltinin 50 mikrolitresi her numune tüpüne girer. Vorteks ve santrifüj beş saniye boyunca kısaca.
DNA bağlama işlemi için tüpü oda sıcaklığında beş dakika bekletin. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünü manyetik bir rafa yerleştirin. Ardından, tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar bekleyin.
Süpernatantı dikkatlice yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Boncukları pipetlemekten kaçının. Orijinal numune hacmine göre.
Pipet 30 mikrolitre manyetik boncuk, vorteks ve santrifüj ile beş saniye kısaca santrifüj yapar. DNA bağlama işlemi için tüpü oda sıcaklığında beş dakika bekletin. 1,5 milimetrelik santrifüj tüplerini manyetik rafa yerleştirin.
Ardından, tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar bekleyin. Süper natantı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
Pipet 300 mikrolitrelik %70 etanol ile 1,5 mililitrelik santrifüj tüpü içine alınır. Ardından, tüpü 180 derecelik bir açıyla iki kez yavaşça döndürün ve iyice yıkamak için boncukları tüp duvarı boyunca hareket ettirin. Pipet takın ve süpernatanı atın.
Boncukları pipetlemekten kaçının. Yıkama prosedürünü bir kez tekrarlayın. Temiz program tamamlandıktan sonra sisteme yeni bir amplifikasyon plakası yerleştirin.
Her biri 150 mikrolitre kırma çözeltisi iki ile önceden doldurulmuş toplama tüplerini rotora yerleştirin, ardından köprüyü toplama tüplerinin üzerine yerleştirin. Reaksiyon yağını tüpün yarısına ve emülgatör kırma çözeltisini tüpün üçte birine ekleyin. Şablon hazırlama için yeni bir filtreyi, örnek portalı yukarı doğru konumlandırılmış bir tüp rafına yerleştirin.
Çözeltiyi beş saniye boyunca vorteksleyin ve beş saniye boyunca kısa bir süre santrifüj yapın. Ardından, 800 mikrolitreyi üç kez pipetledikten sonra çözeltiyi filtrenin numune portalına aktarın. Son enjeksiyondan önce kabarcıkları azaltmak için tüpü santrifüj edin.
Filtreye hava enjekte etmekten kaçının. Karışık çözeltiyi takiben 200 mikrolitre reaksiyon yağı iki enjekte edin. Filtrenin örnek portalını aşağı doğru çevirin ve yıkama adaptasyonunu filtreyle değiştirin.
Numune iğnesini rotor kapağının orta deliğine yerleştirin ve ardından iğneyi tabana bastırın. Ekrandaki Çalıştır düğmesine tıklayın ve programı ilgili kite göre seçin. Ardından tüm adımları kontrol etmek için Yardımlı'yı seçin.
Koşu başlayana kadar İleri'ye tıklayın. Koşunun tamamlanması yaklaşık 4,5 saat sürecektir. Program bittiğinde İleri'yi seçin.
Sistem 10 dakikalık bir santrifüjleme işlemine başlayacaktır. Santrifüjlemeden sonra, Kapağı Aç düğmesine tıklayın ve toplama tüplerini raflara taşıyın. Prosedür 15 dakika içinde bir sonraki adıma geçmezse, yeniden santrifüj yapmak için son dönüşe basın.
Süpernatantı toplama tüpünde çıkarın ve tüpte 100 mikrolitre çözelti bırakın. Kalan numuneyi pipetle karıştırın ve numuneyi OT işaretli yeni 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Süper nanattı pipetlediğinizde, borunun dibine yanlar boyunca dokunmaktan kaçının. Pipet 100 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu her toplama tüpüne aktarır ve çözeltiyi OT tüpüne tekrar tekrar pipetleme ile yıkayarak aktarır.
Toplam bir mililitre hacmini oluşturmak için OT tüpüne 600 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Vorteks, sekiz dakika boyunca 15, 500 kez G'de santrifüjde 30 saniye boyunca. OT tüpünde 100 mikrolitre çözelti bırakarak süpernatantı yavaşça çıkarın.
Yağ tabakasını tamamen atmak için ucu kullanın. 900 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin, 30 saniye boyunca vorteks yapın ve sekiz dakika boyunca 15.500 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı çözeltinin 20 mikrolitresi kalana kadar çıkarın ve 100 mikrolitre hacmini oluşturmak için şablon askıya alma çözeltisini ekleyin.
Sonra 30 saniye boyunca vorteks ve iki saniye boyunca kısaca santrifüj yapın. Numune işlemeden sonraki 12 saat içinde bir sonraki adıma geçin Seyreltilmiş kütüphanenin 100 mikrolitresini, 130 mikrolitre C1 boncuğunu, 300 mikrolitre üç x şablon yıkama çözeltisini ve 300 mikrolitre eritme çözeltisini sekiz kuyucuk şeridine yükleyin. Sekiz kuyucuk şeridini Zenginleştirme Modülüne takın, pipetleme ucunu yükleyin ve 200 mikrolitrelik santrifüj tüpünü toplama konumuna getirin.
Programı çalıştırmak için Başlat'a tıklayın. Pipet, numune çözeltisinin 55 mikrolitresini alır ve çipin numune deliğine enjekte eder. Çipi santrifüj üzerine yerleştirin.
Çentiği dışarıya ve örnek portalı içeriye doğru tutun. Ardından, kullanılmış başka bir talaş ve santrifüjle 10 dakika boyunca dengeleyin. Yükleme çözümünü metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın.
Köpüklenme çözeltisine 100 mikrolitre hava üfleyin. Kabarcıklar yoğun, köpüren bir duruma gelene kadar çözeltiyi tekrar tekrar pipetleyin ve köpük hacmini yaklaşık 250 mikrolitrede tutun. Çipi santrifüjden sonra tezgahın üzerine yerleştirin.
Numune deliğine 100 mikrolitre köpük enjekte edin ve ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalına çıkarın. Ardından, çipi 30 saniye boyunca kısaca santrifüj yapın. Bu işlemi bir kez tekrarlayın.
İki kez% 50 yıkama tamponunda 100 mikrolitre enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın. Daha sonra% 50 tavlama tamponuna üç kez 100 mikrolitre enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalında çıkarın. % 50 enzim reaksiyon tamponuna 65 mikrolitre enjekte edin, kabarcıklardan kaçının ve ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın.
Yüklenen çipi oda sıcaklığında beş dakika boyunca stabilize edin ve çipi sıralayıcı çip portalına takın. Planlanan programı seçin, bilgileri kontrol edin ve çalıştırmayı başlatın. Temsili çalışma toplam 17.6 gigabayt veri elde etti ve iyon küresi parçacığının toplam yükleme oranı, çipin toplam kuyularında% 88 idi.
Isı haritası, toplam talaş alanına numune yüklemesini bile doğruladı. Toplam okumaların %77'si kullanılabilirdi. ISP yüklü tüm kuyular,% 78'inin klonal olduğu% 100 şablon zenginleştirmesi gösterdi.
Tüm klonal şablonların% 97'si son kütüphane olarak nitelendirildi. Okumanın ortalama uzunluğu 177 baz çifti iken, medyan ve mod sırasıyla 176 ve 174 baz çifti idi. Şablonlardaki timin, sitozin ve adenin tepe sayıları, 50'lik nitelikli kesme çizgisi üzerinde yaklaşık 76 idi.
Canlı ISS'lerin bulunduğu tüm adreslenebilir kuyularda% 99,5'i inşa edilmiş kütüphane olarak nitelendirildi ve poliklonal ve düşük kaliteli kütüphanelerin% 20'si filtrelenirken, ISS'lerin% 76,6'sı daha fazla analiz için kalifiye edildi. Tek bir örneklemden alınan kopya sayısı varyansının sonucu, kromozom dört üzerinde P 16.3 ila Q 35.2'nin 182.16 megabaz çifti mozaik trizomisini ve Kromozom 22'de Q 11.1 ila Q 13.33'ün 33 nokta 13 megabaz çifti monozomi segmentini göstermiştir. Parça seçimi yapılırken, adımlar arasındaki zaman aralıkları, ön ve arka uç numuneler için fazla maruz kalma ve maruz kalmamayı önlemek için aynı partideki numunelerin boyutuna göre değiştirilmelidir.
