Этот протокол представляет процедуру от амплификации одиночных клеток до окончательных отчетных данных в предимплантационном генетическом тестировании на анеуплоидию на платформе секвенирования следующего поколения на основе полупроводников. Эта процедура может помочь зрителям хорошо понять экспериментальный рабочий процесс секвенирования PGT-A и воспроизвести этот метод в диагностической лаборатории с платформой NGS на основе полупроводников. Начните с пипетирования 25 микролитров продуктов амплификации всего генома и переноса их в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку, предварительно загруженную 25 микролитрами воды без нуклеазы.
Вихрь и смешайте бусины очистки ДНК. Aliquot 50 микролитров этого раствора в каждую пробирку. Вихрь и центрифуга ненадолго в течение пяти секунд.
Установите трубку на пять минут при комнатной температуре для процесса связывания ДНК. Вставьте 1,5-миллилитровую центрифужную трубку в магнитную стойку. Затем подождите, пока все магнитные шарики притянутся к боковой стенке трубки.
Осторожно перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Избегайте пипетки бусин. По первоначальному объему образца.
Пипетка 30 микролитров магнитных шариков, вихрь и центрифуга ненадолго в течение пяти секунд. Установите трубку на пять минут при комнатной температуре для процесса связывания ДНК. Вставьте 1,5-миллиметровые центрифужные трубки в магнитную стойку.
Затем подождите, пока все магнитные шарики притянутся к боковой стенке трубки. Осторожно удалите и выбросьте супернатант. Избегайте пипетки бусин.
Пипетка 300 микролитров 70% этанола в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Затем осторожно поверните трубку дважды под углом 180 градусов и переместите бусины вдоль стенки трубки для тщательной промывки. Пипетку и выбросьте супернатант.
Избегайте пипетки бусин. Повторите процедуру умывания один раз. Поместите новую усилительную пластину в систему после завершения очистки программы.
Вставьте в ротор коллекторные трубки, каждая из которых предварительно заполнена 150 микролитрами, разбивая раствор два, затем поместите мост на трубы сбора. Добавьте реакционное масло к половине трубки, а эмульгатор разрушает раствор к одной трети трубки. Поместите новый фильтр для подготовки шаблона на стойку для трубок с порталом образца, расположенным вверху.
Вращайте раствор в течение пяти секунд и центрифугируйте ненадолго в течение пяти секунд. Затем перекладывают раствор в образец портала фильтра после пипетки 800 микролитров три раза. Центрифугируйте трубку, чтобы уменьшить пузырьки перед последней инъекцией.
Избегайте нагнетания воздуха в фильтр. Вводят 200 микролитров реакционного масла два, следуя за смешанным раствором. Поверните портал образца фильтра вниз и замените моющий приспособлен фильтром.
Вставьте иглу образца в центральное отверстие крышки ротора, а затем прижмите иглу к дну. Нажмите на кнопку Run на экране и выберите программу согласно соответствующему комплекту. Затем выберите Assisted (С помощью assisted), чтобы проверить все шаги.
Нажмите кнопку Далее, пока запуск не начнется. Пробег займет примерно 4,5 часа. Нажмите кнопку Далее после завершения работы программы.
Система запустит 10-минутный процесс центрифугирования. После центрифугирования нажмите кнопку «Открыть крышку» и переместите коллекционные трубки в стойки. Если процедура не переходит к следующему шагу в течение 15 минут, нажмите на заключительный отжим для повторной центрифуги.
Удалите супернатант в пробирке для сбора, оставив в трубке 100 микролитров раствора. Смешайте оставшийся образец путем пипетирования и перенесите образец в новую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку с маркировкой OT. При пипетке супернатанта избегайте касания дна трубки по бокам. Пипетка 100 микролитров свободной от нуклеазы воды в каждую сборную трубку и перекладывает раствор в отеверженную трубку, промытую повторным пипетированием.
Добавьте 600 микролитров воды без нуклеазы в трубку ОТ, чтобы составить общий объем одного миллилитра. Вихрь в течение 30 секунд в центрифуге при 15, 500 раз G в течение восьми минут. Аккуратно удалите супернатант, оставив 100 микролитров раствора в отеновой трубке.
Используйте наконечник, чтобы полностью отбросить слой масла. Добавьте 900 микролитров воды без нуклеазы, вихрь в течение 30 секунд и центрифугу в 15, 500 раз g в течение восьми минут. Удалите супернатант до тех пор, пока не останется 20 микролитров раствора, и добавьте шаблон повторного использования раствора, чтобы он составил объем 100 микролитров.
Затем вихрь в течение 30 секунд и кратковременно центрифугировать в течение двух секунд. Переходим к следующему этапу в течение 12 часов после обработки образца Загрузите 100 микролитров разбавленной библиотеки, 130 микролитров бусин С1, 300 микролитров трех растворов для промывки шаблонов x и 300 микролитров расплава раствора на восемь полос скважины. Установите восемь полос колодца на модуль обогащения, загрузите наконечник для дозирования и установите трубку центрифуги мощностью 200 микролитров в положение сбора.
Нажмите кнопку Пуск, чтобы запустить программу. Пипетка 55 микролитров образца раствора и впрыскивание его в отверстие образца чипа. Установите чип на центрифугу.
Держите выемку снаружи и портал образца внутри. Затем сбалансируйте его с помощью другого использованного чипа и центрифуги в течение 10 минут. Подготовьте загрузочный раствор, как описано в тексте рукописи.
Вдуйте 100 микролитров воздуха в пенящийся раствор. Пипетку раствором многократно до тех пор, пока пузырьки не придут в плотное, вспенивающееся состояние и сохраняйте объем пены примерно до 250 микролитров. Поместите чип на скамейку после центрифуги.
Введите 100 микролитров пены в отверстие для образца и удалите экструдированный раствор в наружный портал. Затем центрифугируйте чип ненадолго в течение 30 секунд. Повторите этот процесс один раз.
Дважды вводят 100 микролитров в 50% промывочный буфер и удаляют экструдированный раствор в наружный портал после каждой инъекции. Затем вводят 100 микролитров в 50% буфер отжига три раза и удаляют экструдированный раствор в наружный портал после каждой инъекции. Вводят 65 микролитров в 50% буфер реакции ферментов, избегая пузырьков и удаляя экструдированный раствор в наружном портале.
Стабилизируйте загруженный чип при комнатной температуре в течение пяти минут и установите чип на портал чипа секвенсора. Выберите Запланированную программу, проверьте информацию и запустите запуск. Репрезентативный прогон получил в общей сложности 17,6 гигабайт данных, а общая скорость загрузки частицы ионной сферы составила 88% в общих скважинах чипа.
Тепловая карта подтвердила даже загрузку образцов на общую площадь чипа. 77% от общего числа прочитанных материалов были пригодны для использования. Все скважины, загруженные ISP, показали 100% обогащение шаблонов, в которых 78% были клональными.
Из всех клональных шаблонов 97% были квалифицированы как окончательная библиотека. Средняя длина считывания составила 177 пар оснований, в то время как медиана и режим составили 176 и 174 пары оснований соответственно. Пиковое количество тимина, цитозина и аденина в шаблонах составило примерно 76 по сравнению с квалифицированной линией отсечения 50.
Во всех адресуемых скважинах с живыми интернет-провайдерами 99,5% квалифицировались как построенная библиотека и 20% поликлональных и низкокачественных библиотек были отфильтрованы, в то время как 76,6% интернет-провайдеров были квалифицированы для дальнейшего анализа. Результат дисперсии числа копий от одного образца изобразил мозаичную трисомию пар мегабаз 182,16 от P 16,3 до Q 35,2 на хромосоме четыре и 33 точечных 13 пара мегабазовых пар моносомного сегмента от Q 11,1 до Q 13,33 на хромосоме 22. При выполнении отбора фрагментов временные интервалы между этапами должны быть изменены в соответствии с размером образцов в одной и той же партии, чтобы предотвратить чрезмерное и отсутствие экспозиции для образцов переднего и заднего торцев.
