이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 염기서열 분석 플랫폼에서 이수성을 위한 착상 전 유전자 검사에서 단일 세포 증폭에서 최종 보고 데이터에 이르는 절차를 제시합니다. 이 절차는 시청자가 PGT-A 시퀀싱의 실험 워크플로우를 잘 이해하고 반도체 기반 NGS 플랫폼이 있는 진단 실험실에서 이 기술을 복제하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 25마이크로리터의 전체 게놈 증폭 산물을 피펫팅하고 25마이크로리터의 뉴클레아제 자유수가 미리 로드된 1.5밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.
DNA 정제 비드를 와동시키고 혼합한다. 이 용액 50 마이크로리터를 각 샘플 튜브에 분취합니다. 소용돌이와 원심 분리기가 5 초 동안 잠깐 지속됩니다.
DNA 결합 과정을 위해 실온에서 5 분 동안 튜브를 설정하십시오. 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브를 마그네틱 랙에 삽입합니다. 그런 다음 모든 마그네틱 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 기다립니다.
상청액을 새로운 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 구슬을 피펫팅하지 마십시오. 원래 샘플 볼륨에 따라.
30 마이크로 리터의 자기 비드를 피펫팅하고 5 초 동안 와류와 원심 분리합니다. DNA 결합 과정을 위해 실온에서 5 분 동안 튜브를 설정하십시오. 1.5mm 원심분리기 튜브를 마그네틱 랙에 삽입합니다.
그런 다음 모든 자기 비드가 튜브의 측벽에 끌릴 때까지 기다리십시오. 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
300 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 튜브를 180도 각도로 부드럽게 두 번 돌리고 튜브 벽을 따라 비드를 움직여 철저히 씻습니다. 피펫팅하고 상청액을 버린다.
구슬을 피펫팅하지 마십시오. 세척 절차를 한 번 반복하십시오. 깨끗한 프로그램이 완료되면 시스템에 새 증폭판을 놓습니다.
각각 150 마이크로 리터로 미리 채워진 수집 튜브를 로터에 삽입 한 다음 수집 튜브에 브리지를 놓습니다. 튜브의 절반에 반응 오일을 추가하고 튜브의 1/3에 유화제 차단 용액을 추가합니다. 샘플 포털이 위쪽으로 배치된 튜브 랙에 템플릿 준비를 위한 새 필터를 놓습니다.
용액을 5 초 동안 소용돌이 치고 5 초 동안 짧게 원심 분리합니다. 그런 다음 800 마이크로 리터를 3 회 피펫 팅 한 후 용액을 필터의 샘플 포털로 옮깁니다. 마지막 주입 전에 기포를 줄이기 위해 튜브를 원심분리합니다.
필터에 공기를 주입하지 마십시오. 200 마이크로리터의 반응 오일을 주입하고, 혼합 용액에 이어 한다. 필터의 샘플 포털을 아래쪽으로 돌리고 세척 적응을 필터로 교체하십시오.
샘플 바늘을 로터 뚜껑의 중앙 구멍에 삽입한 다음 바늘을 바닥으로 누릅니다. 화면에서 실행 버튼을 클릭하고 해당 키트에 따라 프로그램을 선택하십시오. 그런 다음 지원을 선택하여 모든 단계를 확인합니다.
실행이 시작될 때까지 다음을 클릭합니다. 실행을 완료하는 데 약 4.5시간이 걸립니다. 프로그램이 완료되면 다음을 선택합니다.
시스템은 10분 원심분리 프로세스를 시작합니다. 원심분리 후 뚜껑 열기 버튼을 클릭하고 수집 튜브를 랙으로 이동합니다. 절차가 15 분 안에 다음 단계로 이동하지 않으면 최종 스핀을 눌러 다시 원심 분리합니다.
수집 튜브에서 상청액을 제거하고 튜브에 100 마이크로 리터의 용액을 남깁니다. 나머지 샘플을 피펫팅으로 혼합하고 샘플을 OT라고 표시된 새로운 1.5밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상청액을 피펫팅할 때 측면을 따라 튜브 바닥을 만지지 마십시오. 100 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 각각의 수집 튜브에 피펫팅하고, 용액을 반복 피펫팅으로 세척된 OT 튜브로 옮긴다.
600 마이크로 리터의 뉴 클레아제 자유수를 OT 튜브에 추가하여 1 밀리리터의 총 부피를 구성합니다. 8 분 동안 15, 500 회 G에서 원심 분리기에서 30 초 동안 와동. OT 튜브에 100 마이크로 리터의 용액을 남기고 상청액을 부드럽게 제거하십시오.
팁을 사용하여 오일 층을 완전히 버립니다. 900 마이크로 리터의 뉴 클레아제 자유 물을 넣고 30 초 동안 와동시키고 15, 500 배 G에서 8 분 동안 원심 분리합니다. 20 마이크로리터의 용액이 남을 때까지 상청액을 제거하고 100 마이크로리터의 부피를 구성하기 위해 주형 재현탁 용액을 첨가한다.
그런 다음 30 초 동안 소용돌이 치고 2 초 동안 잠시 원심 분리합니다. 샘플 처리 후 12시간 이내에 다음 단계로 진행하여 희석된 라이브러리 100마이크로리터, C1 비드 130마이크로리터, 300마이크로리터의 3x 템플릿 세척 용액 및 300마이크로리터의 용융 용액을 8개의 웰 스트립에 로드합니다. 농축 모듈에 8개의 웰 스트립을 설치하고 피펫팅 팁을 로드한 다음 200마이크로리터 원심분리 튜브를 수집 위치에 놓습니다.
시작을 클릭하여 프로그램을 실행하십시오. 55 마이크로리터의 샘플 용액을 피펫팅하여 칩의 샘플 구멍에 주입한다. 칩을 원심 분리기에 놓습니다.
노치는 바깥쪽으로, 샘플 포털은 안쪽으로 유지하십시오. 그런 다음 사용한 다른 칩과 균형을 맞추고 10 분 동안 원심 분리합니다. 텍스트 원고에 설명 된대로 로딩 솔루션을 준비하십시오.
발포 용액에 100 마이크로 리터의 공기를 불어 넣습니다. 기포가 조밀하고 거품이 나는 상태가 될 때까지 용액을 반복적으로 피펫팅하고 거품 부피를 약 250마이크로리터로 유지합니다. 원심 분리 후 칩을 벤치에 놓습니다.
100마이크로리터의 폼을 샘플 구멍에 주입하고 압출된 용액을 아웃 포털로 제거합니다. 그런 다음 칩을 30초 동안 짧게 원심분리합니다. 이 과정을 한 번 반복하십시오.
100 % 세척 완충액에 50 마이크로 리터를 두 번 주입하고 매 주입 후 아웃 포털에서 압출 용액을 제거합니다. 그런 다음 50 % 어닐링 버퍼에 100 마이크로 리터를 세 번 주입하고 매 주입 후 아웃 포털에서 압출 용액을 제거합니다. 65 % 효소 반응 완충액에 50 마이크로 리터를 주입하여 기포를 피하고 아웃 포털에서 압출 용액을 제거합니다.
적재 된 칩을 실온에서 5 분 동안 안정화하고 시퀀서 칩 포털에 칩을 설치하십시오. 계획된 프로그램을 선택하여 정보를 확인하고 실행을 시작합니다. 대표적인 실행은 총 17.6 기가 바이트 데이터를 얻었으며 이온 구 입자의 전체 로딩 속도는 칩의 전체 웰에서 88 %였습니다.
히트 맵은 전체 칩 영역에서 샘플 로딩도 확인했습니다. 전체 읽기 횟수의 77%를 사용할 수 있었습니다. ISP가로드 된 모든 우물은 100 % 템플릿 농축을 보여 주었고 78 %는 클론이었습니다.
모든 클론 템플릿 중 97%가 최종 라이브러리로 인정되었습니다. 판독의 평균 길이는 177 염기쌍이었고 중앙값과 최빈값은 각각 176 및 174 염기쌍이었습니다. 템플릿에서 티민, 시토신 및 아데닌의 피크 수는 적격 컷오프 라인 50에서 약 76이었습니다.
라이브 ISP가 있는 주소 지정이 가능한 모든 웰에서 99.5%가 구축된 라이브러리로 인정되었고 20%의 다클론 및 저품질 라이브러리가 필터링되었으며 76.6%의 ISP가 추가 분석을 위해 검증되었습니다. 단일 샘플로부터의 복제 수 분산의 결과는 염색체 4에서 P 16.3 내지 Q 35.2의 182.16 메가베이스 쌍 모자이크 삼염색체 및 염색체 22 상에서 Q 11.1 내지 Q 13.33의 33 점 13 메가베이스 쌍 단일체 세그먼트를 나타내었다. 조각 선택을 수행할 때 단계 사이의 시간 간격은 동일한 배치의 샘플 크기에 따라 수정하여 전면 및 후면 샘플에 대한 과다 및 노출 부족을 방지해야 합니다.
