We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Manutenção de animais e protocolos experimentais foram aprovados pelos cuidados e uso Comitês da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Animais Institucional, e atender a todas as necessidades do Gabinete NIH of Laboratory Animal Welfare e da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International. NOTA: Para obter larvas para análise ERG, publicado protocolos para criação de peixe-zebra padrão e manutenção foram empregados 18. As larvas são obtidas através da reprodução natural e alojados sob um ciclo claro / escuro de 10 horas 14 horas de luz. Este protocolo foi optimizado para as larvas em 5-7 dias pós-fertilização (DPF), mas poderia idealmente ser realizada em peixes mais velhos com pequenas modificações para o procedimento. Aqui, use a tensão TL de tipo selvagem larvas do peixe em 5 dpf. 1. Micropipeta Produção <ol><li> Puxe vários micropipettes usando 1,5 x 0,86 milímetros (diâmetro externo de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato polido-fogo comfilamento (temperatura de fusão, 821 ° C) e um P-97 Flaming / Brown Micropipeta extrator equipado com filamento caixa calor. Usar o programa para formar micropipetas descritos na Tabela 1. </li><li> Verifique cada micropipeta sob um microscópio com um governante graticule adequadas para garantir que as pontas são de 10-15 m de diâmetro e tem uma abertura de ponta suave (ou seja, sem bordas irregulares). </li><li> Armazenar cuidadosamente micropipetas para evitar danos ponta e exposição ao pó. As opções de armazenamento incluem placas de Petri com fita laboratório, caixas forradas com espuma, ou recipientes de armazenamento micropipeta comercialmente disponíveis. NOTA: Outros puxadores de micropipeta de vidro capilares e podem ser usadas, desde que o diâmetro correcta da micropipeta e uma ponta de alta qualidade seja atingido. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pressão </td><td> Calor </td><td> Puxe </td><td> Velocidade </td&gt; <td> Tempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Programa para a produção de micropipetas usando um P-97 flamejante / castanho Micropipeta Puller equipado com um filamento caixa de calor são feitas usando micropipetas de 1,5 x 1,0 mm2 (diâmetro exterior de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato-polidas ao fogo, com filamentos. (temperatura de fusão, 821 ° C). 2. Preparação Tampão <ol><li> Use filtrada, tampão oxigenado de Ringer peixe 19 no capilar de microeléctrodos e para saturar a esponja de álcool polivinílico (PVA), sobre o qual as larvas são colocadas para experiências. Como alternativa, use E3<html> meios de embrião ou de Solução Salina Equilibrada de Hank. </li><li> Preparar a solução de Ringer 10x peixe, tal como descrito na Tabela 2. Ajustar a pH 7,8, esterilizar e utilizando um filtro de 0,22 um e armazenar o estoque de 10x a 4 ° C. </li><li> Criar uma solução de trabalho no dia do experimento, diluindo a solução 10x de Ringer para 1x com água deionizada, destilada. Filtrar através de um sistema de filtro de 0,22 um. Composto oxigenado por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 gasoso durante 10 minutos. Cap firmemente depois de assegurar que a solução permanece oxigenado. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Quadro 2: Preparação de solução 10x peixinho de Ringer. 3. Eletrorretinograma Platform <ol><li> Realizar experiências ERG sobre uma mesa de anti-vibração no interior de uma gaiola de Faraday para melhorar a relação sinal-ruído. Anexar uma plataforma de aço sob encomenda para a mesa de anti-vibração utilizando porcas. Coloque uma plataforma móvel de plástico com um polímero uretano de absorção de choque inferior viscoelástico sobre a mesa sob a fonte de luz. </li><li> Posicione a câmera com um stand magnetizado, voltado para baixo, para a plataforma móvel de plástico. Posicione o micromanipulator (que vai realizar a gravação de microeletrodos) com um segundo posto magnetizado para a direita da plataforma de plástico móvel. Assegure-se que a câmara e micromanipulador não será perturbada pelo movimento de outros equipamentos e que não bloqueiam a iluminação proveniente da fonte luminosa. </li><li> Ligue a câmara a um monitor de vídeo e posicioná-la para ver o olho dolarva para colocar o eletrodo na posição adequada. </li><li> Certifique-se de que a instalação esteja devidamente aterrado com fio de cobre. Para verificar o barulho, coloque o eletrodo de referência e na ponta do microeletrodos de gravação em um prato de 35 milímetros Petri preenchido com solução de Ringer. Verifique os níveis de ruído elétrico da instalação com um osciloscópio ou um recurso embutido do aparelho ERG. Os níveis de ruído não deve ser mais do que ± 10 mV a partir da linha de base. </li></ol> 4. Esponja Preparação <ol><li> Corte um retângulo pequeno de esponja de PVA seco que vai caber confortavelmente em uma placa de Petri de 35 mm. A espessura da esponja não deve ser maior do que a profundidade do prato. Use uma faca com uma lâmina de barbear limpa para o corte. </li><li> Realizar uma redução adicional na esponja para acomodar o eléctrodo de referência (ou um corte raso longitudinalmente na parte inferior da esponja ou uma borboleta cortado verticalmente através de uma das extremidades mais pequenas). </li><li> Use um marcador resistente a produtos químicospara marcar um pequeno ponto na esponja (onde a larva será colocado) que pode ser utilizado para posicionar a câmara. </li><li> Mergulhe a esponja PVA na solução de Ringer até à saturação. Retire e seque rapidamente sobre uma toalha de papel 2-3 vezes. Coloque a esponja em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri. </li><li> Posicionar a placa de Petri contendo a esponja sobre a plataforma de plástico de modo a que a marca pode ser visualizado pela câmara. </li></ol> 5. Preparação Eletrodo NOTA: A configuração do peixe-zebra consiste em um eléctrodo de referência em contacto com a solução saturada de PVA a esponja de Ringer e um eléctrodo de gravação em contacto com a córnea. O eletrodo de referência é constituído por uma pelota de Ag / AgCl. O eléctrodo de registo de uma micropipeta de vidro é puxado cheio com solução de Ringer e realizada por um suporte de microeléctrodo contendo um fio de Ag. <ol><li> Do cloreto de eletrodos, mergulhando-os em solução de hipoclorito de sódio a 6-9% (água sanitária) para 5 min (a micr gravaçãowire oelectrode) ou 15 minutos (o eletrodo de referência). Ar seco sobre um Kimwipe durante 5 min. <ol><li> Dependendo do estilo do corte feito no Passo 4.2, coloque o pellet Ag / AgCl do eletrodo de referência em (para o corte borboleta vertical) ou menos (para o corte raso longitudinal na parte inferior) da esponja. Fixe o cabo-eletrodo de referência para o sistema de gravação. </li><li> Alternativamente, se a configuração do ERG tem limitações de espaço ou não são particularmente fortes artefatos fotovoltaicos do eletrodo Ag / AgCl, conecte o eletrodo de referência para a esponja através de uma ponte de sal agar para mover o eletrodo para fora do caminho da luz. </li></ol></li><li> Anexar ~ 40 cm do tubo de tamanho adequado para a 5 ml de não-bloqueio Luer da seringa. Encha a seringa com solução de Ringer. Titulares microeletrodos que possuem portas de pressão são tipicamente enviados com adaptadores para acomodar tubos com diâmetros internos de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;ou 5/32&quot;. </li><li> Encha um 1 ml Luer não seringa fechadura comSolução de Ringer e, usando um Micro-fil, preencha cuidadosamente o suporte de microeletrodos. Evitar a formação de bolhas. </li><li> Fixe a seringa de 5 ml para a porta de pressão do titular do microeletrodos com tubulação e usá-lo para garantir que o titular da microeletrodos está cheio de solução de Ringer. Usando o Micro-fil e 1 ml cheia com solução de Ringer, encher o copo micropipeta a partir da ponta e assegurar que não há bolhas de ar. </li><li> Fixe a micropipeta de vidro para o titular da microeletrodos, tendo o cuidado de manter a linha reta fio do eletrodo. Uma vez garantido, a utilizar seringa de 5 ml para forçar cuidadosamente solução de Ringer através do microeléctrodo até que uma pequena quantidade de solução é visível na ponta. Aplicação ocasional de pressão para a seringa (não quando aplicado a córnea) vai impedir a formação de bolhas de ar, bem como oclusões devido à acumulação de pó ou sal, na ponta da micropipeta. <ol><li> Se a solução sai como uma corrente, substituir o gmicropipeta moça, como a abertura da ponta é muito grande ou está danificado. </li></ol></li><li> Com cuidado, coloque o microeletrodos de gravação no micromanipulator e anexar a liderança para o sistema de gravação. </li></ol> 6. Análise Eletroretinograma NOTA: Devido ao predomínio cone da retina larval, os resultados do ERG de alta qualidade pode ser obtido quando os preparativos para a gravação são realizadas sob baixos níveis de luz branca indireta (&lt;1 lux) ou com curtos períodos de tempo (&lt;1 min) de maior intensidade ( ≤250 lux) luz de trabalho. Um curto período de adaptação ao escuro ainda é necessária antes da gravação (veja o passo 6.7). No entanto, experimentos podem ser realizados sob luz vermelha ou infravermelha dim usando uma câmera infravermelha de minúsculas. Todos os experimentos foram realizados em esterilizada por filtração (0,22 mm) de água do sistema do Mecanismo UNC Zebrafish aquicultura mas a mídia embrião alternativos podem ser utilizados. <ol><li> Corte quadrados de papel toalha medindo aproximadamente 1cm 2. </li><li> Se a medição potencial de receptor isolado massa cone, incubar 3-5 larvas em água do sistema com 500 uM (±) -2-4-Amino-phosphonobutyric ácido (APB) durante 5 min. NOTA: Enquanto APB é uma mistura racémica do composto activo (G) e inactivos formas de AP4 (R), é tão eficaz como a L-AP4 e é menos dispendiosa. </li><li> Anestesiar 3-5 larvas em água sistema com 0,02% (w / v) tricaina até sem resposta, cerca de 1-2 min. </li><li> Use uma bomba de pipeta e pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente larvas indivíduo para quadrados de papel toalha sob um estereoscópio dissecando com uma iluminação mínima (≤250 lux para &lt;1 min). Verifique a posição de cada larva e escolher um candidato que é lateral-se dorsal com um olho não obstruído. <ol><li> Para gravações prolongados (&gt; 30 min), manter a larva úmida por vidros do corpo até, mas não incluindo a cabeça com 3% de metilcelulose usando um pincel fino de pêlo de camelo. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça, transferir o squar toalha de papele com a larva à esponja úmida PVA. <ol><li> Para as gravações prolongados (&gt; 30 min), aplicar um fluxo contínuo de água saturado de 100% de O2 do gás através da larva, fazendo borbulhar o gás através de um difusor em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o tubo que sai do lado do braço balão que transmite o oxigênio umidificado perto da cabeça do larva. NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo irá prolongar a vida do peixe 16. </li></ol></li><li> De acordo com um mínimo de iluminação, use o micromanipulator e câmera para posicionar a ponta de microeletrodos no ponto médio entre o nasal e extremidades caudais do olho e pressione suavemente sobre o limite dorsal da córnea. NOTA: Extravio da ponta do eletrodo para as áreas muito distantes da córnea pode resultar em formas de onda ERG de polaridade invertida. </li><li> Permitir larva para dark-se adaptar para 5-10 min. </li><li> Registrar as respostas flash de teste a luz fornecida a partir de uma fonte de luz LED ou estimulador ótico usando o avaiestimulação e gravação de equipamentos lable. Ajuste os parâmetros do protocolo, como a intensidade do flash, comprimento flash, cor flash, intensidade de fundo e configurações de cores e filtros para atender o experimento. </li><li> Quando terminar com o experimento, a eutanásia larvas de acordo com as diretrizes AVMA / IACUC. </li></ol>

<ol>
	<li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The retina: an approachable part of the brain. , (1987).</li><li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates.">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li><li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).</li><li>Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics.">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li><li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina.">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2++and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof.">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li><li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation.">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li><li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+visual+system+development:+more+than+meets+the+eye.">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li><li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish,+brachydaniorerio.+II.+Function.">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li><li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+development+in+the+zebrafish,+Daniorerio:+light+and+electron+microscopic+analyses.">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish.">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li><li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio.">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li><li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram.">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li><li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EML1+(CNG-modulin)+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors.">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li><li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram.">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).</li><li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level.">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li><li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+mutants.">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li><li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+(Cyprinidae).">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li><li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+(Cyprinidae).">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li><li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials.">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroretinogram+(ERG)+Measurements+in+Larval+Zebrafish.">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae.">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li><li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M&#252;ller+glial+cells,+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness.">Lazy eyes zebrafish mutation affects M&#252;ller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina.">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo um procedimento simples para gravações ERG de peixe-zebra larval é detalhado. Este procedimento permite uma análise rápida e abrangente de function.There visual são vários passos críticos em todo o procedimento que deve ser mantido em mente. O larvas do peixe deve ser saudável antes do experimento para impedir a morte durante os tratamentos potenciais da droga e garantir meios de subsistência prolongada durante as gravações do ERG. Além disso, é importante que as larvas utilizadas nas exper...

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo electrofisiológico que tem sido amplamente utilizado na clínica para determinar a função da retina em seres humanos. A actividade eléctrica em resposta a um estímulo de luz é medida colocando os eléctrodos de gravação sobre a superfície externa da córnea. As características do paradigma do estímulo e a resposta forma de onda de definir os neurónios da retina que contribuem para a resposta. Este método foi adaptado para utilização com um número de modelos animais, incluindo ratinhos e peixes-zebra. A resposta típica do ERG vertebrado tem quatro componentes principais: a uma onda, que é um potencial negativo córnea provêm de uma actividade celular de fotorreceptores; da onda b, um potencial positivo córnea derivado da EM células bipolares; a-d onda, um potencial positivo córnea interpretado como a actividade das células bipolares Off; e o c-ondas, que ocorre alguns segundos após a onda b e reflecte a actividade em Müller glia e a retinal epitélio pigmentar 1-4. Referências adicionais para a compreensão da história e os princípios de análise ERG em humanos e animais modelo são o livro on-line, WebVision, da Universidade de Utah e textos como os Princípios e Práticas de Eletrofisiologia Visual Clínica 4, 5. Danio rerio (peixe-zebra) tem sido favorecido como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à sua rápida maturação e transparência, o que permite uma análise morfológica não invasivo dos sistemas de órgãos, e ensaios comportamentais e inverso telas genéticos (para revisão, ver e Fadool Dowling 6). Larvas do peixe são altamente passíveis de manipulação genética e farmacológica, que, quando combinada com sua alta fecundidade, torná-los um modelo animal excelente para análises biológicas de alto rendimento. A maior proporção de cones para hastes no peixe-zebra larval - cerca de 1: 1 em comparação com os ratinhos (~ 3% de cones) - os tornam particularmente úteis para o estudo da função dos cones 7-9. Na retina de vertebrados, cones desenvolver antes de hastes 10. Curiosamente, cones de peixe-zebra são operativas logo em 4 dpf, permitindo a análise eletrofisiológica seletiva de cones nessa fase 6, 11,12. Em contraste, as respostas de ERG em hastes aparece entre 11 e 21 dpf 13. Portanto, larvas do peixe em 4-7 dpf servir funcionalmente como uma retina all-cone. No entanto, o photopic ERG resposta nativo de 4-7 larvas dpf é dominado pela onda b. Aplicação de agentes farmacológicos, tais como a L - (+) - 2-amino-4-butírico-ácido fosfono (L-AP4), um agonista para o receptor de glutamato metabotrópico (mGluR6) expressa pela SOBRE células bipolares, bloqueia eficazmente a geração da onda b e revela o potencial isolado massa cone receptor, (a &quot;uma onda&quot;) 14-17. Aqui nós descrevemos um simples e reliable método para análise do ERG usando equipamentos disponíveis comercialmente ERG concebido para utilização com ratos que foram adaptados para uso com larvas de peixes-zebra. Este sistema pode ser utilizado em larvas do peixe de diferentes origens genéticas, bem como aqueles tratados com agentes farmacológicos, para ajudar os investigadores na identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e adaptação de luz 16. Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo vai orientar os pesquisadores no uso de análise ERG para responder a uma variedade de questões biológicas relacionadas à visão, e demonstrar a construção de uma configuração flexível ERG.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2170">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1504px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday cage</td>
			<td>80/20 Inc</td>
			<td>custom</td>
			<td>Custom designed aluminum &#34;Industrial Erector Set&#34; for Cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVA sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000ZOWG1C</td>
			<td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 ml Sterile Filter systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Espion E2</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colordome</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Holding and positioning the recording microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic ring stand</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-025-MB</td>
			<td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lead extensions</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-LX</td>
			<td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:333px;">Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>DF-215/10</td>
			<td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Window screen frame (metal) and spline</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td>various</td>
			<td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steriflip 50 ml filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC adaptor</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>4127</td>
			<td>Connecting camera to BNC cable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC cable</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>626</td>
			<td>Connecting camera to video adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1582232</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera coupler</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1501149</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td>
			<td>Sewell</td>
			<td>SW-29297-PRO</td>
			<td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1910</td>
			<td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&#176;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P97 Flaming/Brown puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>For pulling glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbothane sheet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SB12A</td>
			<td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>B2436F</td>
			<td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Isolation Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PWA074</td>
			<td>Provides vibration isolation to breadboard</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper mesh</td>
			<td>TWP</td>
			<td>022X022C0150W36T</td>
			<td>To line Faraday Cage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera</td>
			<td>Watec</td>
			<td>WAT-902B</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-fil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH2SW15</td>
			<td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DRIREF-5SH</td>
			<td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode (alternative)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-noise cable for Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>13620</td>
			<td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo para a determinação electrofisiológico da função retiniana. Através da colocação de um eléctrodo sobre a superfície da córnea, a actividade eléctrica gerada em resposta à luz pode ser medido e utilizado para avaliar a actividade das células da retina in vivo. Este manuscrito descreve o uso do ERG para medir a função visual em peixe-zebra. Zebrafish têm sido utilizada como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à facilidade de supressão do gene por oligonucleótidos morfolino e manipulação farmacológica. Em 5-10 dpf, apenas cones são funcionais na retina das larvas. Por isso, o peixe-zebra, ao contrário de outros animais, é um sistema poderoso modelo para o estudo da função visual cone in vivo. Este protocolo utiliza anestesia standard, micromanipulação e protocolos lupa estereoscópica que são comuns em laboratórios que realizam pesquisa de peixe zebra. Os métodos descritos fazer uso de eq eletrofisiologia padrãouipment e uma câmera de luz baixa para orientar o posicionamento da microeletrodos gravação sobre a córnea larval. Finalmente, é mostrado como um ERG estimulador / gravador comercialmente disponível originalmente concebido para ser utilizado com os ratos podem ser facilmente adaptados para uso com o peixe-zebra. ERG de peixe-zebra larval proporciona um excelente método de ensaio de função visual cone em animais que tenham sido modificadas por morfolino injecção de oligonucleótidos, bem como mais recentes técnicas de engenharia do genoma, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), activador de transcrição-Como efector As nucleases (TALENS), e Agrupamentos regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) / Cas9, todos os quais têm aumentado consideravelmente a eficiência e eficácia do gene alvo em peixes-zebra. Além disso, tirar vantagem de a capacidade de agentes farmacológicos para penetrar larvas de peixes-zebra para avaliar os componentes moleculares que contribuem para o foto-resposta. Este protocolo descreve uma instalação que pode ser modificado e utilizado pelos investigadorescom vários objetivos experimentais.

Normalmente, ERGs são registrados a partir de larvas do peixe em 5 dpf, uma vez que uma série de estudos publicados gravações ERG, nesta fase, 9, 16,20. Respostas larval foram medidos em condições de adaptação ao escuro, sem iluminação de fundo usando a 20 ms estímulo de luz LED branco. Utilizamos um sistema ERG comercialmente disponível consiste em um estimulador luz Ganzfeld e computador controller / gravador. O estimulador utiliza um sistema de modulação de largura de pulso rigidamente contro...

Watch this Scientific Journal Video about Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K visualizações.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Vídeo: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurociência

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

A resposta optocinético como uma medida quantitativa da acuidade visual em Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

Padrões morfológicos do potencial evocado cortical Visual específico do estímulo

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Usando larvas de zebrafish para estudar as conseqüências patológicas do curso hemorrágico

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

Análise de Sistemas da Resposta Neuroinflammatória e Hemodinâmica à Lesão Cerebral Traumática

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...