Este método permitirá que o pesquisador teste sistemas difíceis de estudar, como peptídeos e íons metálicos de transição de primeira linha, ambos geralmente desafiadores usando aplicações mais padrão. A principal vantagem aqui é usar técnicas ortogonais porque elas se complementam bem, e isso pode dar mais insights sobre o sistema e nos ajudar a não perder nenhum fenômeno. O método detalhado neste vídeo é muito adequado para estudar outros sistemas.
Embora mostremos com(II) e um peptídeo, ele pode ser usado para muitas interações diferentes de peptídeos metálicos e proteínas metálicas. Acho que a parte mais difícil será encontrar uma boa escolha tampão para o seu íon de metal e peptídeo. Eu consultaria a literatura para ver quais tampões foram usados por outros antes.
demonstrando o procedimento será Sohee Choi, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório de pesquisa. Para começar, ligue o espectrômetro de absorção eletrônica e deixe aquecer por aproximadamente 15 a 20 minutos antes do uso. Em seguida, inicie o software espectrômetro e configure os parâmetros, como alcance de digitalização de 200 a 900 nanômetros, a faixa de varredura de 200 nanômetros por segundo e a linha de base de feixe duplo corrigida.
Em seguida, colete uma linha de base sem cuvetas ou amostras nos caminhos do feixe. Usando duas cuvetas combinadas no espectrômetro de feixe duplo, carregue uma cuvette com 115 microliters de água ultrapura e a outra cuvette com 115 microliters da amostra de peptídeo, garantindo que não haja bolhas de ar nas cuvetas, pois estas interferirão com o sinal. Depois, coloque a cuvette com água ultrapura no feixe de referência e a cuvette com peptídeo no feixe de amostra.
Em seguida, colete o espectro de absorção do peptídeo sem metal. Adicione uma quantidade substoichiométrica da solução(II) no cuvette com a amostra de peptídeo e registe o volume para análise posteriormente. Tubo suavemente para cima e para baixo para misturar a solução, evitando a geração de bolhas de ar.
Depois de equilibrar por cinco minutos, coloque o cuvette de volta no suporte da célula da amostra e registe o espectro de absorção. Em seguida, repita a adição de alíquotas de(II) na solução de peptídeo para vários equivalentes e registe o volume total de(II) adicionado ao cuvette. Depois de inicializar o software como descrito anteriormente em duas cuvetas combinadas carregam uma cuvette com 115 microliters de água ultra pura e outras cuvette com 115 microliters da solução complexa cobre-fen.
Coloque a cuvette com água no feixe de referência e a cuvette com solução complexa de cobre-phen no feixe de amostra. Em seguida, colete o espectro de absorção do complexo de ligantes metálicos. Depois, adicione uma quantidade estequiométrica de peptídeo à solução complexa cobre-fen e tubo suavemente que para cima e para baixo para misturar completamente enquanto cuidado para não introduzir quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, incubar a solução por cinco minutos para alcançar o equilíbrio. Coloque o cuvette de volta no suporte da célula da amostra e registe o espectro de absorção. Mais tarde, repita a adição de alíquotas de peptídeos na solução complexa de cobre-fen para vários equivalentes, e registe o volume de peptídeo adicionado para que a concentração diluída possa ser determinada.
Primeiro ligue o ITC e inicie o software ITC para executar o instrumento. Após a primeira inicialização, recoloque o burette e siga as instruções na tela. Em seguida, remova a burette e a tampa da célula de referência.
Em seguida, remova qualquer água da célula de referência e enxágue três vezes com 450 microliters de água ultra pura desgaseada. Desenhe lentamente água ultra pura para a marca de 450 microliters de uma seringa de carga tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na seringa. Em seguida, insira a seringa de carregamento na célula de referência até que esteja a aproximadamente um milímetro da parte inferior e injete lentamente parte da solução até que 150 microliters permaneçam na seringa de carga.
Depois, mova o êmbolo da seringa de carga rapidamente para cima e para baixo por aproximadamente 25 microliters várias vezes para desalojar quaisquer bolhas na superfície celular. Em seguida, injete lentamente até que o êmbolo atinja a marca de 100 microliters na seringa de carregamento, distribuindo assim um total de 350 microliters de água ultra pura na célula de referência e substitua a tampa da célula de referência. Depois de remover qualquer solução residual da célula amostra, carregue 450 microliters de 10 mililitros EDTA usando uma seringa de carregamento e mergulhe por 10 minutos para garantir que os íons metálicos sejam removidos porque o EDTA ligará metais de traço.
Depois de remover a solução EDTA enxágue completamente a seringa de carregamento com quantidades abundantes de água ultra pura. Limpe o ITC de acordo com as instruções do fabricante enxaguando a célula amostral com água ultra pura. Remova qualquer água residual da célula amostral e, em seguida, condicionar a célula amostrada enxaguando com 450 microliters de buffer pelo menos três vezes.
Em seguida, remova o tampão residual que está condicionando a célula amostral e carregue a solução de peptídeo na célula amostral usando a seringa de carregamento. Em seguida, enxágue a seringa de titulação com 200 microliters da solução tamponada, removendo primeiro o êmbolo. Usando uma micro pipeta, pipeta a solução tampão através do orifício na parte superior da seringa de titulação de vidro através da seringa e para fora da agulha abaixo.
Mais tarde, insira totalmente o êmbolo na seringa de titulação. Em seguida, mergulhe a ponta da agulha de seringa de titulação na solução metálica e puxe lentamente o êmbolo para cima fazendo com que a solução metálica encha a seringa e resultando em um volume vazio na parte superior da parte de vidro da seringa de titulação. Para remover o volume vazio gire a seringa de titulação paralela ao chão.
Em seguida, remova o êmbolo e incline ligeiramente a parte de vidro em direção ao chão. Agite suavemente a seringa de titulação para que a solução se mova para a parte de vidro da seringa de titulação e preencha a maior parte do volume vazio. Mas certifique-se de que dois ou três microliters de volume vazio permaneçam.
Mantendo a seringa paralela ao chão reinserir o êmbolo. Em seguida, segure a seringa de titulação e mergulhe a ponta da agulha de volta na solução metálica. Em seguida, empurre o êmbolo para baixo até que o ar deixe de sair da agulha e carregue a seringa de titulação puxando lentamente o êmbolo para pouco acima da marca de 50 microliters, mantendo a ponta da agulha na solução.
Insira cuidadosamente a parte de vidro da seringa de titulação na burette e enrosque até que o dedo esteja apertado. Depois, utilizando um limpador delicado de serviço leve, absorva a solução que sai da seringa de titulação devido à compressão do êmbolo sem tocar na ponta da agulha. Em seguida, insira a burette com uma seringa de titulação na célula amostral e fixe-a com segurança.
Para configurar os parâmetros do software ITC, selecione o Controle de Instrumentos. Defina a taxa de agitação e a temperatura. Em seguida, em Detalhes do Experimento, entre na seringa e nas concentrações celulares em unidades milimães.
Em seguida, na seção Método de Experimento selecione Titulação Incremental. Clique em Configuração e especifique 20 injeções de 2,5 microliters e se for necessário mais resolução para observar o evento de ligação aumentar o número de injeções e diminuir o volume por injeção. Depois, insira o espaçamento de tempo entre cada injeção para que seja longo o suficiente para que o sinal se equilibre e retorne à linha de base, normalmente 300 segundos.
Em seguida, clique no botão Executar para iniciar o experimento e especifique onde os dados são salvos. A titulação de(II) foi realizada em C-Peptídeo demonstrando que a adição de 150 micromolar de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nanômetros atribuídos à banda d-d de(II) e continuou a aumentar até que 300 milmolar(II)foi adicionado. Além disso, acima de 300 micromolar(II) não aumentou a absorção da proibição d-d indicando saturação e que(II)se liga ao C-Peptídeo em um complexo 1:1 com um valor de log K de mais de seis.
C-Peptídeo foi titulado em aproximadamente 10 complexos de cobre-fenimene micromolar e a absorção da faixa de transferência de carga em 265 nanômetros diminuiu indicando que o C-Peptídeo foi capaz de quilatar(II) do ligante de fenanthrolina com um valor de log K de 7,4 a 7,8. O termograma ITC mostra a titulação de 1,4 milimiliar(II) em 154 micromolar C-Peptídeo em 15 milimiliar de mPS tampão. Verificou-se que a afinidade de ligação tinha um valor de log K de oito com alteração na entalpia como 8 kilojoules por toupeira.
Gibbs energia livre como menos 46 kilojoules por toupeira, e mudança na entropia como 120 joules por toupeira por kelvin. Uma titulação controlada de 1,4 milimalha(II) em 15 milimilhas de buffer MOPS na ausência de C-Peptídeo não mostra nenhuma vinculação no termograma. Eu diria que ter certeza de que está tudo limpo.
Se houver íons metálicos ou peptídeos que sobraram de experimentos anteriores, pode afetar drasticamente a estequiometria e fornecer competição desconhecida nos experimentos de ligação. O dicromaísmo circular é outro método para estudar as interações de peptídeos metálicos ou proteínas metálicas porque olha para a quiralidade. A espectrometria em massa também pode interrogar esses complexos olhando para mudanças na massa.
Este conjunto de técnicas tem sido usado por muitos laboratórios que estudam íons metálicos interagindo com peptídeos ou proteínas.
