MA foi apoiado por uma bolsa de Schrödinger do Fundo austríaco Science (FWF, J3086-B11) e graças a Max-Planck-Sociedade de apoio financeiro e administrativo. GS e JH foram apoiados pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS13-030).

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The authors declare that they have no competing financial interest.

Medição de interacções proteína-proteína in situ é altamente desejável, especialmente quando se lida com as interacções de baixa afinidade, tais como ligação de TCR-pMHC 11. Isto é porque a taxa de sobre-, bem como a estabilidade de tais interacções são significativamente influenciadas pelas circunstâncias particulares sob as quais ligação ocorre. Abordagens de imagem baseados em FRET minimamente invasivos são, portanto, em princípio, perfeitamente adequado para tais tarefas, ainda envolver uma série de obstáculos que devem ser superados primeiro. O ruído gerado por autofluorescência celular limita a sensibilidade das medidas e deve, portanto, ser mantidos a um mínimo. Microscopia TIRF serve essa necessidade muito bem 12, mas exige a funcionalização de vidro-slides, idealmente sob a forma de uma bicamada lipídica planar suportada em vidro decorado com proteínas de escolha 13-15. Outra vantagem de uma abordagem que é parcialmente reconstitutive parceiros FRET recombinantes bicamada residente pode ser muito mminério facilmente marcada em um, local específico forma quantitativa e racional com fluoróforos menores e mais brilhantes do que seria possível com proteínas expressas na superfície de células. TCRs são marcados com scFv recombinante s, que não influenciam o reconhecimento de células T, como foi anteriormente testada 2. Além disso, a composição de proteína do SLB, por exemplo, a densidade de pMHCs e a escolha dos factores de acessório pode ser ajustado para a necessidades específicas. Temos experiências previamente realizada com diferentes densidades de pMHCs estimulantes, mas não detectaram diferenças significativas em 2D-koff e 2D-K D 2. Até agora aqui o reconhecimento de moléculas do MHC da classe II tem sido tratado com apenas, principalmente por causa da natureza da sua fenda de ligação peptídeo, que é aberto em ambas as extremidades e, assim, acomoda péptidos maiores, incluindo um ligante para a fixação fluoróforo. Em alguns casos, esta abordagem pode também trabalhar para a rotulagem MHC class I moléculas 16, mas grande cuidado deve ser tomado para verificar a sua utilização em experiências. A sensibilidade das células T contra os antigénios, os quais podem ser medidos através de ensaios de proliferação de células T, assim como a cinética de ligação pMHC-TCR tal como medido in vitro por ressonância de plasma de superfície não deve ser afectada pela adição do ligante e fluoróforo para o péptido. Alternativamente, MHC de classe I próprias moléculas podem ser marcados de uma maneira específica do local, com a introdução de uma cisteína não emparelhado no interior da sequência da cadeia pesada (observações não publicadas). Com a utilização de sondas moleculares apropriados qualquer interacção proteína-proteína sináptica pode, em princípio, ser estudados de uma forma aqui descrita. Essas sondas, por exemplo, Proteínas Projetado Ankyrin Repetir (DARPins) 17, a SCF V s ou deveria ser monovalente e deve vincular seu alvo de forma estável, sem afetar a interação de interesse. Claro, informatio estruturaln é altamente desejável para a concepção racional de sonda, mas não absolutamente necessário. Ao estabelecer um novo par de FRET parceiros, recomenda-se para gravar e analisar FRET em grandes quantidades em primeiro lugar. Locais de ligação da etiqueta pode variar consideravelmente para maximizar o sinal de FRET e também para verificar que os rendimentos medidos FRET variar em função da distância inter-corante. Uma vez que o sistema é otimizado, única molécula FRET sinais podem ser gravados através da limitação da rotulagem do FRET parceiro alta abundância de 10-30% e branqueamento da FRET parceiro baixa abundância até moléculas individuais são resolvidos no campo da iluminação. Por último, mas não menos importante, deverá ser notado que SLBS aproximar alguns, mas não todos os aspectos da membrana plasmática fisiológico. Qualidades tais como curvatura da membrana e flexibilidade, domínio compartimentalização, rearranjos do citoesqueleto e a motilidade celular, bem como uma elevada variedade de proteínas de membrana de superfície não-expressos são representados por SLBS mas pode influenciar tele processar sob investigação. Muito esforço terá de ser investido para estabelecer modalidades de imagem que permitem a monitorização interações proteína-proteína com resolução molécula única em sinapses fisiológicas, que são inacessíveis a imagem TIRF.

Uma compreensão mais fundamental de como as células T reconhecem os antígenos requer olhar para o lugar certo, ou seja, dentro da sinapse imunológica formado entre a célula T e do APC. Aqui, a cinética de ligação molecular não são apenas determinadas pelas propriedades bioquímicas intrínsecas dos parceiros de interacção envolvidos, mas dependem em grande medida dos parâmetros celulares, que incluem forças celulares, a arquitectura da membrana e das interacções laterais entre as proteínas da membrana, bem como as restrições geométricas específicas da sinapse 3. Abordagens bioquímicas são limitados em potência de resolução como eles exigem a disrupção de, pelo menos, uma das membranas sinápticas envolvidas. Por esta razão, uma metodologia de imagem baseados em FRET foi desenvolvido para monitorar a ligação do TCR para pMHCs antigênicas 2. Aqui as células T são decorados com um recombinante e de site especificamente rotulado TCRβ-reativa de cadeia simples fragmento de anticorpo (SCF V) e confrontados com plano<html> AR bicamadas lipídicas suportada em vidro (SLBS), que abrigam as moléculas MHC de classe II carregadas com um péptido antigénico marcado por fluorescência, moléculas co-estimulatórias e proteínas de adesão. Synaptic ligação entre TCR e corante marcado marcadas com corante de resultados pMHC em FRET, que podem ser monitorados em um único volume e nível molécula pela Total Internal Reflection fluorescência microscopia (TIRF). Neste artigo é explicado em detalhe como utilizar SLBS para ensaiar sinapses das células T, verificar sua integridade através de um ensaio de cálcio-flux de células T funcional, conduta FRET medições a granel e com sensibilidade única molécula, e analisar os dados adquiridos. Recomendações são oferecidas para a produção de proteínas adequadamente conformado necessários para bicamada funcionalização. Para obter informações mais específicas sobre a formação de bicamada e configuração de um microscópio TIRF adequado, consulte a uma publicação JoVE acesso público adicional publicada volta para trás 4. tenda &quot;&gt; Nature de SLBS SLBS functionalizable pode ser prontamente gerado a partir de vesículas unilamelares (SUVs) que contém os dois lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-gylcero-3-fosfocolina (curto: POPC, 90-99%) e 1,2-sn dioleoyl- - glicero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético] succinil} (curto: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs, distribuídos em lâminas de vidro limpas para formar uma bicamada planar contígua 4. DGS-NTA-Ni serve para ancorar proteínas marcadas com poli-histidina-complexo através de formação mediada por poli-histidina, com o NTA-Ni que contém um grupo de cabeça (Figura 1A) sintético. Para uma associação estável substitui tipicamente o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática nativa da proteína de adesão ICAM-1 e a molécula co-estimuladora B7-1 com uma etiqueta contendo doze histidinas (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . O péptido carregado-classe II K IE molécula contém duas cadeias polipéptido incorporado-membrana (α e β)s. Os transmembranares / domínios citoplásmicos de ambas as cadeias têm que ser substituídos com uma etiqueta de seis histidinas contendo cada (IE k α 6H β 6H k -2x6H ou IE). Como uma alternativa, que se prolonga a cadeia com doze α histidinas e deixando o domínio extracelular da cadeia β não marcado (dando origem a IE k α 0H 12H β ou IE k -12H) dá origem a resultados satisfatórios (Figura 1B). Rotulagem específica do local de pMHCs É importante para marcar o local e pMHC estequiometricamente-especificamente, a fim de ser capaz de converter os rendimentos medidos em FRET constantes de ligação de equilíbrio significativas. Isto pode ser conseguido pela marcação química de um péptido sintético que é carregado para a fenda de ligação ao péptido de recombinante marcada com histidina moléculas MHC de classe II 2,5. O péptido inclui todos os resíduos do epitopo de célula T como well como um curto C-terminal ligante (GGS) seguido por cisteína (por exemplo, a traça do citocromo c (MCC) péptido ANERADLIAYLKQATK- GGSC, o ligante é marcado em negrito). Esta cisteína é utilizado para marcar o péptido estequiometricamente com o uso de derivados de maleimida com corante. Neste ponto, cuidado extra deve ser dedicada à verificação quantitativa corante de acoplamento para o peptídeo contendo cisteína. HPLC de purificação do aducto de péptido-corante é recomendado e deve ser seguido por espectroscopia de massa por ionização por electropulverização. Quaisquer massas gravados correspondentes ao educto peptídeo (sem corante) refletem rotulagem incompleta. Se isto é verdade, o péptido purificado por HPLC-deve ser submetido a ciclos consecutivos de-marcação com corante até que a rotulagem é considerada quantitativa. Note-se que a espectroscopia de massa MALDI-TOF deve ser evitada dado que este método envolve a radiação laser para uma amostra de ionização. Este tratamento se desintegra as fluorophores sensíveis ligados antes de massa peptídeo é lido e, portanto, underrepre<html> graus Sents de dye-conjugação. Ainda marcação indirecta do local específico de TCR ligado de células com a utilização de fragmentos de cadeia simples Fv monovalente Ele ainda é um desafio para anexar corantes para celular proteínas associadas à superfície de células vivas de uma maneira específica do local. Para superar este obstáculo para TCRs expostos à superfície, uma versão monovalente de cadeia única (scFv) a partir dos genes do anticorpo monoclonal TCRβ Reativo H57-197 2 foi construído. A estrutura cristalina deste anticorpo em complexo com o TCR permite conceber racionalmente uma versão, na qual um resíduo de serina em estreita proximidade com o terminal C do péptido associado MHC (em que o corante parceiro de FRET correspondente está ligado) é substituído por um resíduo de cisteína. Este mutante de cisteína, em seguida, serve como um aceitador para a conjugação de corantes (Figura 2). Metodologias para gravar FRET nt &quot;&gt; valores FRET em massa são os mais adequados para verificar a relação entre as distâncias inter-dye escolhidos e FRET eficiências medidos neste TCR-pMHC sistema 2 vinculativa. Além disso, as medições FRET granel revelar diferenças qualitativas e quantitativas na sinápticas afinidades TCR-pMHC ( ver abaixo e secção protocolo 3.2). Várias abordagens para quantificar a eficiência FRET foram introduzidos na literatura 6. Neste artigo é registada por meio de FRET (a) doador recuperação após aceitante de branqueamento, e via (b) emissão de aceitador FRET sensibilizados. O primeiro método (a) exige a utilização de um aceitador FRET que pode ser facilmente Foto-descoloração, e um doador, a qual é bastante fotoestável. Além disso, é importante assegurar que o aceitador de Foto-descoloração não é mais capaz de extinguir a fluorescência do dador. À medida que o mesmo canal de detecção (doador) é usado para a quantificação, sem factores de correcção umd há aberrações cromáticas devem ser considerados, o que torna esta metodologia simples e confiável. No entanto, as medidas quantitativas não pode ser repetida no mesmo local de amostra e mudanças na FRET não podem ser gravadas ao longo do tempo. Para evitar efeitos causados ​​pela difusão molecular ou motilidade celular um passo de branqueamento rápido deve ser orientado para, o que minimiza o tempo que passa entre o primeiro doador FRET (antes receptor de branqueamento) e a segunda aquisição de imagens FRET doador (depois de FRET receptor de branqueamento). É recomendado empregar uma poderosa fonte de luz laser do comprimento de onda de excitação aceitador FRET, a fim de minimizar a iluminação e de branqueamento vezes. Em contraste, na abordagem da medição das emissões de FRET sensibilizado (b) o dador FRET é animado e a emissão do aceitador FRET é observado no canal aceitador FRET. Alterações na sinal aceitador FRET pode ser gravado, mas ao longo do tempo de emissão do doador FRET para o canal receptor vermelho-deslocada (termed exsudação) e FRET aceitante cross-excitação via doador excitação tem que ser determinado com exactidão e subtraído do canal receptor de FRET gravado. Para isso as imagens correspondentes aceitador FRET doador e traste tem que ser espacialmente alinhados. A detecção de única molécula (sm) FRET eventos Com o uso de lasers como fonte de excitação, uma câmara sensível e microscopia TIRF-ruído atenuado a fluorescência de fluoróforos individuais podem ser facilmente rastreada ao longo do tempo. Semelhante é verdadeiro para a detecção de eventos smFRET intermoleculares. No entanto, as complicações podem ser causados ​​por FRET exsudação dador e trans-excitação do aceitador FRET, e, assim, grande cuidado deve ser tomado ao ajustar as densidades fluoróforo na experiência smFRET. No protocolo fornecido abaixo (seção de protocolo 4) a TCR foi escolhido como FRET doadores em alta abundância e pMHC como FRET aceitante em baixa abundância. Para atenuar FRET doador suficientemente exsudação, decorar 10-30% dos TCRs com FCE fluorescente V e 90-70% dos TCRs com FCE não fluorescente V. Aqui, o canal de aceitador FRET foi escolhido como único canal molécula porque é confocal com a única molécula FRET canal. Isto ajuda a alinhar com eventos smFRET molécula única aceitadores de FRET, que é a base de validação smFRET. Extraindo-off taxas sinápticas através de medições smFRET Fotodegradação de ambos FRET doador e receptor FRET tem que ser contabilizado ao extrair a meia-vida de interações de única molécula FRET vestígios. O número de sinais observáveis ​​FRET no início da sua aparência como par dador-aceitador individuais n (0) é reduzido ao longo do tempo, tanto unbinding do fotobranqueamento e complexo ligando-receptor. O número de sobreviventes complexos num dado momento N (t) pode ser expresso matematicamente como se segue: No termo fotobranqueamento exp (-t / τ lixívia) o tempo t é descrita pelo produto do número de observações N e o tempo de iluminação t mal por causa da observação de modo não-contínua, discreta (isto é, de branqueamento ocorre apenas durante a iluminação ). Dentro do termo cinética exp- (t / τ desligado) o tempo t é o produto do número de observações n e t o intervalo de tempo para uma única observação FRET (isto é, acontece continuamente unbinding cinética). Equação 1 pode ser expressa como: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> O termo τ lixívia / τ doente describes o número de observações até branqueamento ocorre e é definido como o valor esperado &lt;n branquear&gt; da sua função exponencial. A equação 2 pode ser simplificada, como se segue: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> O valor esperado &lt;N (t lag)&gt; do número de quadros de N (t) com FRET eventos observáveis ​​após o tempo t é determinado directamente a partir da experiência. Depende do tempo ajustável entre as observações (t lag) escolhidos no experimento e os valores desconhecidos para τ off (o inverso da taxa de off k off) e &lt;n branquear&gt;, o valor esperado do número de observações antes de ocorrer branqueamento . Assim, o cálculo do valor esperado &lt;N (t lag)&gt; para, pelo menos, dois valores de t <sub&gt; lag permite a determinação experimental de &lt;n branquear&gt; e τ off. Extraindo valores sinápticas 2D-K D através de medições baseadas em FRET Medindo uma ocupação de TCR, isto é, a razão entre os TCRs e ligados no total TCR, é fundamental para a determinação dos valores de K-sinápticos 2D d. De acordo com a equação 4 este termo é directamente proporcional à medida FRET produzir TCR, desde que serve como dadores e aceitantes pMHCs como FRET FRET. <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> com uma ocupação = TCR, C = fator de conversão C é uma constante, que depende do sistema de FRET e os fluoróforos utilizado. Ele pode ser determinado experimentalmente, conforme mostrado abaixo. um pode ser convertido num 2D-K D de acordo com a equação 5, quando odensidade inicial de ligandos de TCR, antes da adição de células T para a bicamada é conhecido. Isto é devido à grande mobilidade das proteínas SLB-inscritos e também porque SLBS fornecer um reservatório quase inesgotável de ligantes 2. <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> com [pMHC inicial] = densidade inicial de pMHC antes da adição de células T Com equações 4 e 5 pode-se agora facilmente determinar o sináptica 2D-K D entre TCR e pMHC. Isso é feito mais com medições FRET com base na recuperação de doadores após o clareamento receptor (ver seção de protocolo 3.1). No entanto, à medida C a relação entre a intensidade de FRET FRET I (corrigido para o fundo, de FRET exsudação dador e aceitador FRET cruzada excitação) e TCR ocupação um tem de ser determinado. Para isso, umaprecisa de saber a relação R entre a intensidade média de fluorescência de fluoróforos individuais TCR-associados FRET doadores (por exemplo, Cy3 ou AF555) sm I doador FRET e a intensidade média de molécula única FRET FRET I sm eventos. R depende do sistema de FRET em questão, e filtros de emissão de câmara utilizada para a detecção de fluorescência. A ocupação de um TCR pode então ser determinado directamente de acordo com a equação 6. <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> com R = sm I FRET doador / sm I FRET R foi determinado como 1,45 para o sistema de scFv H57 Cy3 / pMHC-Cy5 leva a: a = massa I FRET / bulk I TCR-cy3 • 1,45 A relação entre a ocupação de TCR a e o rendimento de FRET pode ser determinado por doador FRET recuperary aceitador após branqueamento. Para esta dois parâmetros são representados graficamente contra o outro para um número de TCR microclusters como mostrado na Figura 4A .A inclinação do ajuste linear indica o factor de conversão C (a partir da equação 4). Como demonstrado na Figura 4A, C ascende para (a) o V H57 scF - Cy3 / pMHC-Cy5 sistema FRET e (b) a configuração do sistema de microscópio aplicado a 1.995. A ocupação de um TCR pode ser facilmente deduzido da seguinte forma: A ocupação de um TCR = FRET produzir 1,995 •

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacterial expression</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>insect cell media for baculo virus production</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>insect cell media for baculo virus expression</td></tr><tr><td>Sf9 cells</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>cells for virus production and expansion</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>cells for potein expression</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacterial expression</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>protein concentartion from large volumes</td></tr><tr><td>Centramate cassette 10kDa cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>protein concentartion from large volumes</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Gilson HPLC system</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*250mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*50 mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Gilson HPLC system</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*250mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*50 mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Cy3 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Cy5 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, cell permeant</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>for dissolving fura-2 am</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>imaging buffer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>supplement for imaging buffer</td></tr><tr><td>14-4-4S antibody</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2&amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &amp;micro;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for fura-2-based calcium measurements&amp;nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for (single molecule) FRET measurements</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>planar supported lipid bilayers</td><td></td><td>for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, with L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T-cell media</td></tr><tr><td>non-essential amino acid 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>mouse interleukin-2 recombinant protein</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>Research Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>Origin (analysis program)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td><td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

A gravação de cálcio intracelular através do corante Fura-2 cálcio, bem como a análise celular subsequente para verificar a potência estimuladora e, consequentemente, a funcionalidade do SLBS são mostrados na Figura 4. Conforme se torna evidente, os níveis de cálcio aumentar em células T (expresso como a fura-2 340 nm razão normalizada / 380nm com linha de base sendo 1) imediatamente assim que resolver sobre as SLBS estimulantes. Os níveis de cálcio voltar aos níveis basais logo após a adição de um anticorpo que bloqueia pMHCs TCR de acoplamento e que termina a activação das células T. A Figura 6 ilustra uma experiência típica envolvendo recuperação dador FRET aceitador após o branqueamento, que é utilizado para medir o rendimento FRET e que serve para calcular os valores de 2D-K D (mostrada na Figura 4). Note que o aumento em intensidade dador FRET, que representa TCR marcado através de AF555, após ablação rápida e completa de uma a FRETespécies cceptor (aqui: AF647 associado com pMHCs). Também é evidente a redução forte no canal de FRET, ou seja, o canal de FRET-aceitador FRET sob doador de excitação, após aceitador FRET branqueamento. O sinal remanescente pouco visível corresponde a se preocupar doador exsudação. Rendimentos FRET dentro microclusters TCR individuais ou sinapses inteiras são calculados com base nos valores de intensidade medidos indicados (Figura 6B). A Figura 7 descreve uma trajectória e lapso de tempo de uma única molécula de evento de FRET visível em dois intervalos de tempo. Como descrito acima na introdução tal comportamento é causado por ambos decadência da sináptica TCR-pMHC vinculativo e fotodegradação. Para discriminar entre essas duas contribuições, os prazos de aquisição experimentais tem que ser variada de duração: enquanto fotodegradação continua a ser uma constante, mudanças na FRET comprimento evento trajetória só são causados ​​pelas cinética de ligação. Uma quantificação de tracelengths, W<html> hich constitui a base para o cálculo das taxas de fora do branqueamento e mostrados na Figura 7, são apresentados nas tabelas 1 a 3. Determinação do 2D-K D s exige a gravação de grandes quantidades FRET rendimentos para FRET doadores TCRs rotulados. Com a utilização do experimentalmente deduzida constante C (Figura 4), ​​com um rendimento de FRET medido para um microcluster TCR ou uma sinapse inteira pode ser convertido para o TCR de ocupação, um ou seja, a proporção de TCR pMHC-envolvidos e totais (Figura 4C) . Com densidades pMHC conhecidos presentes no SLB antes da adição das células-T, A valores podem ser utilizados para determinar os valores de KD 2D-sinápticos (Figura 4D). On-taxas pode ser calculado com a lei de ação de massas (2D-k on = 2D-koff / 2D-K D) da sináptica determinada off-rate e valores 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama esquemático do contorno da bicamada lipídica do sistema suportada em vidro plano (SLB). (A) SLBS são compostos de POPC (90-99%) e o lípido sintético DGS de Ni-NTA (1-10%) e formam-se espontaneamente quando as superfícies de vidro limpas são carregadas com vesículas unilamelares pequenas (SUVs) que consiste dos lípidos correspondentes. (B) Uma vez formados, tais SLBS pode ser funcionalizado com porções marcadas com poli-histidina solúveis extracelulares derivadas de co-estimuladoras B7-1 pMHCs, proteínas e proteínas de adesão ICAM-1, para servir como APCs para células-T. Para obter mais informações sobre como preparar SLBS consulte Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Energia de Förster Ressonância ensaio baseado em Transferência para quantificar a ligação de TCR-pMHC in situ. (A) Uma estrutura compósita de um TCR complexado com um fragmento de cadeia única H57 engatar um pMHC ilustra a abordagem baseada em FRET aqui descrito. Note-se a curta distância de cerca de 41a separa os dois fluoróforos correspondentes submetidos FRET. Sites receptora na fluoróforo-maleimidas são indicados em verde e vermelho. (B) O princípio de detecção de interacções TCR-pMHC in situ é ilustrada. Apenas scF V -decorated TCRs e pMHCs (IE aqui k), que formam complexos específicos, dar origem a um sinal FRET mensurável. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. Cromatogramas de ascensão último passo de filtração em gel para dar scFv monoméricos e s carregadas com péptido k -2x6H moléculas IE. Eixos X representam volume de retenção, em ml, eixos Y indicam absorvância a 280 nm em unidades arbitrárias (UA) . (A) Site-H57 especificamente scFv marcado com Alexa Fluor 555 maleimida foi submetido a cromatografia para separar S75 corante que não reagiu a partir da proteína (passo 1.2.5). As fracções correspondentes ao intervalo de retenção de 14 to15 ml (linhas tracejadas) representam marcado H57 scFv monomérico. (B), ou seja moléculas -2x6H k complexados com o ANP-péptido espaço titular UV clivável tinha sido irradiadas com UV, incubadas com o sítio-específico Alex 647 marcado com maleimida péptido e, finalmente, sujeito a cromatografia em S200 para separar a proteína do péptido livre (passo 1.1.2.4). O intervalo entre as linhas tracejadas contém adequadamente dobrados e pMHCs monoméricos. (A, B) </sTrong&gt; 0,7 ml da amostra foi aplicada na coluna no início do rum (0 ponto mL). As fracções recolhidas foram concentradas. A proporção entre proteína e corante foi determinada por photospectrometry antes da diálise contra PBS / glicerol a 50% (para o armazenamento a -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinação 2D-K D S e K em 2D-s. (A) A correlação entre o rendimento de FRET como determinado pela recuperação após branqueamento doador aceitador e TCR ocupação foi medida experimentalmente. TCR ocupação pode ser determinada para microclusters TCR individuais como explicado na secção 4.2. Um ajuste linear dos dados é apresentada pela linha, cuja inclinação é igual à relação entre C TCRocupação eo rendimento FRET. C é uma constante específica para o sistema FRET e os fluoróforos (aqui Cy3 e Cy5) empregados. Neste exemplo, produziu 1.988. (B) FRET dados de rendimento foram determinados por microclusters individuais TCR (N = 187, temperatura = 24 ° C) através da recuperação de doador aceitador de branqueamento. Números abaixo de barras de histograma indica o limite superior do intervalo dentro. (C) A conversão dos dados apresentados em (B) multiplicando os rendimentos medidos FRET com a constante C determinada em (a). Números abaixo de barras indicam o limite superior do intervalo dentro. (D) Histograma (semi-logarítmica, base = 4) que descreve a distribuição de 2D-K D s, medida por microclusters TCR individuais. A mediana 2D-K D é indicado no azul. Números abaixo de barras indicam o limite superior do intervalo dentro. (E) O histograma mostrado em (D) foi convertido intoa 2D-k em -histogram (semi-logarítmica, base = 4) utilizando o k sináptica off para 24 ° C (0,41 s -1). O 2D-k mediana determinado sobre o valor é indicada a azul. Os dados foram originalmente publicado em Huppa et al. 2 e são visualizados aqui em um novo formato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. Validação funcional de SLBS empregue para a estimulação de células T e de imagem. (A) de blastos de células T transgénicas TCR-carregadas com Fura-2 foram confrontados com estimuladora SLB abrigando pMHCs antigénicos, ICAM-1 e B-7. Foram registrados celular fura-2 emissão animado a 340 nm e 380 nm, bem como imagens DIC. Conforme indicado, os valores da relação das intensidades de emissão animado aos 34 anos0 e 380 nm são apresentados no painel da direita. A adição de pMHC anticorpos de bloqueio 14 min para o ensaio experimental resultou numa diminuição nos níveis de cálcio intracelulares, comparável ao do descanso células-T. (B) Um perfil temporal típico de índices médios Fura-2 em células T em contacto com SLBS estimuladoras é caracterizada por um aumento inicial em uma intracelular de cálcio que é de 2 a 4 vezes mais elevada em comparação com a de células T não activadas ou células T privadas de antigénio após o bloqueio mediada por anticorpos. Círculos verdes indicam pontos no tempo em ilustrados (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. massa FRET rendimentos, medida através da recuperação doador FRET FRET aceitante após o clareamento. <strong&gt; (A) é mostrado um exemplo de uma medição de FRET-sináptica normal. Como está indicado no lado esquerdo e na parte superior de uma série de imagens foi adquirida com o uso de um divisor de feixe de emissão dando origem a um dador FRET e um canal de FRET aceitador (para uma informação mais detalhada sobre divisores de feixe referem-se a Axmann et ai 4). A linha mostrada na imagem DIC esquerda indica o limite da sinapse de células T. Note-se a perda de intensidade dentro do canal aceitador FRET bem é o aumento da intensidade do canal de dador FRET após FRET aceitador de branqueamento (etapa 4). (B) FRET eficiências podem ser quantificados como indicado para as regiões sinápticas individuais ou em sinapses inteiras. Para consulta, as imagens antes e depois FRET receptor de branqueamento são mostrados com o uso de duas tabelas de pesquisa (LUTs, verde e física). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. molécula única FRET eventos aparecem e desaparecem passos insingle e estão perfeitamente alinhados com um único fluoróforo aceitador FRET. O lapso de tempo do evento FRET única molécula é mostrado. As imagens foram obtidas utilizando uma câmara EMCCD retro-iluminado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. Determinação τ off = 1 / k fora de trajetórias smFRET medidos. (A) As somas cumulativas normalizadas de sinais observáveis ​​(FRET derivados de H57 scF V -AF555 decorados 5c.c7 TCR blastos de células T transgênico reconhecendo IE &lt;sup&gt; K / K3-AF647 a 24 ° C) durante quatro desfasamentos de tempo diferentes (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms) foram representados graficamente como uma função do número total de observações. Funções de ajuste monoexponencial dar origem a que corresponde o inverso negativo dos valores esperados &lt;n (t lag)&gt;. (B) valores esperados foram plotados contra atrasos t lag e montado usando a equação &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(x off / &lt;n branquear&gt;) + t lag} para produzir τ off e &lt;n branquear&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.3K visualizações.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

Vídeo: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Imunologia e Infecção

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the environment, a cell must be able to recognize and process it. This task mainly relies on the function of membrane receptors, whose role is to convert signals into the biochemical language of the cell. G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptor proteins in humans. Among GPCRs, metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are a unique subclass that function as obligate dimers and possess a large extracellular domain that contains the ligand-binding site. Recent advances in structural studies of mGluRs have improved the understanding of their activation process. However, the propagation of large-scale conformational changes through mGluRs during activation and modulation is poorly understood. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) is a powerful technique to visualize and quantify the structural dynamics of biomolecules at the single-protein level. To visualize the dynamic process of mGluR2 activation, fluorescent conformational sensors based on unnatural amino acid (UAA) incorporation were developed that allowed site-specific protein labeling without perturbation of the native structure of receptors. The protocol described here explains how to perform these experiments, including the novel UAA labeling approach, sample preparation, and smFRET data acquisition and analysis. These strategies are generalizable and can be extended to investigate the conformational dynamics of a variety of membrane proteins.

This study presents a detailed procedure to perform single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) experiments on G protein-coupled receptors (GPCRs) using site-specific labeling via unnatural amino acid (UAA) incorporation. The protocol provides a step-by-step guide for smFRET sample preparation, experiments, and data analysis.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

Bioquímica

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biologia

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Bioengenharia

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Análise de alta resolução da função mitocondrial em PBMCs humanas

High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells

Peripheral mononuclear cells (PBMCs) exhibit robust changes in mitochondrial respiratory capacity in response to health and disease. While these changes&#160;do not always reflect what occurs in other tissues, such as skeletal muscle, these cells are an accessible and valuable source of viable mitochondria from human subjects. PBMCs are exposed to systemic signals that impact their bioenergetic state. Thus, expanding our tools to interrogate mitochondrial metabolism in this population will elucidate mechanisms related to disease progression. Functional assays of mitochondria are often limited to using respiratory outputs following maximal substrate, inhibitor, and uncoupler concentrations to determine the full range of respiratory capacity, which may not be achievable in vivo. The conversion of adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP) by ATP-synthase results in a decrease in mitochondrial membrane potential (mMP) and an increase in oxygen consumption. To provide a more integrated analysis of mitochondrial dynamics, this article describes the use of high-resolution fluorespirometry to measure the simultaneous response of oxygen consumption and mitochondrial membrane potential (mMP) to physiologically relevant concentrations of ADP. This technique uses tetramethylrhodamine methylester (TMRM) to measure mMP polarization in response to ADP titrations following maximal hyperpolarization with complex I and II substrates. This technique can be used to quantify how changes in health status, such as aging and metabolic disease, affect the sensitivity of mitochondrial response to energy demand in PBMCs, T-cells, and monocytes from human subjects.

Autor em destaque: novos insights sobre as respostas mitocondriais do PBMC usando fluorespirometria

Methods for studying mitochondrial bioenergetics under physiologically relevant substrate concentrations in immune cells are limited. We provide a detailed protocol that uses high-resolution fluorespirometry to assess changes in the response of the mitochondrial membrane potential to energy demand in human T-cells, monocytes, and peripheral mononuclear cells.

Medição de TCR-pMHC Binding

Resumo

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