O modelo TMEV é uma das primeiras plataformas experimentais a permitir a investigação dos mecanismos de desenvolvimento de crises como consequência da infecção do SNC. As infecções do SNC aumentam significativamente o risco de epilepsia. Este modelo ajuda a identificar potenciais alvos terapêuticos e compostos para pacientes em risco.
Os experimentadores devem ser treinados para trabalhar com camundongos. A injeção do vírus pode ser muito bem praticada injetando corante em animais mortos para alcançar precisão e rotina suficientes. Quem demonstrará o procedimento será Laura Bell, aluna de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, remova a tampa da seringa de insulina e adicione tubos de polietileno como um colar ao redor da agulha para garantir uma profundidade de injeção adequada de 2,5 milímetros. Em seguida, submerja a seringa em etanol por 30 minutos e coloque a seringa sob luz UV por 30 minutos. Em seguida, coloque a tampa de volta na agulha e envolva a seringa em uma bolsa esterilizante.
Tape a bolsa para fechá-la e rotule com a data de preparo. Para realizar a injeção de vírus, obtenha alíquotas da cepa Daniels de TMEV do freezer de 80 graus Celsius negativos. Descongelar o vírus e mantê-lo no gelo.
Em seguida, carregue a seringa com a suspensão do vírus. Depois, limpe a bancada com desinfetante e trabalhe sob um absorvedor de fumos. Transfira o camundongo anestesiado da caixa de anestesia sob o capô e verifique a tolerância cirúrgica realizando uma pinça do dedo do pé.
Em seguida, limpe a cabeça do animal com uma almofada de álcool e incline a cabeça do rato ligeiramente para a esquerda para que o local de injeção esteja apontando para cima. Puxe a pele um pouco para trás e insira a agulha na cabeça. Em seguida, injetar 20 microlitros por via intracorídica a uma profundidade de 2,5 milímetros na região temporal do hemisfério direito.
Deixe a seringa no lugar por cinco a 15 segundos e verifique se há vazamento da injeção ou se bolhas de ar são vistas, em seguida, prepare uma nova seringa. Ao retirar cuidadosamente a seringa, gire-a ligeiramente. Em seguida, transfira o animal para uma nova gaiola, que é colocada meio ligado, metade de uma almofada de aquecimento durante a recuperação da anestesia.
E não deixe os animais desassistidos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Primeiro, leve todas as gaiolas para o banco e observe os animais para convulsões duas vezes ao dia durante a fase leve. Pontuar a atividade convulsiva por uma escala de corrida modificada e relatar o número e a intensidade das crises.
Em seguida, deslize uma caneta pela gaiola para fazer algum barulho e transfira cada animal para outra caixa e vice-versa. Para animais que não se agarraram espontaneamente ou após agitação suave da gaiola, desencadeie convulsões por manuseio mais intenso enquanto vira cuidadosamente o rato, virando-o em sua cauda da esquerda para a direita. Observe novamente o comportamento das crises em cada animal e repita o processo para as gaiolas subsequentes.
As crises comportamentais foram registradas se ocorreram durante injeções de drogas ou durante as sessões subsequentes de monitoramento do manuseio das crises. Os dados observados foram apresentados como um mapa de calor criado pela representação dos estágios convulsivos em diferentes cores. Através do registro do EEG, vários eventos epilépticos podem ser identificados na fase crônica, meses após a infecção por TMEV.
A quantificação da degeneração hipocampal e dos camundongos infectados com TMEV epiléptico mostra uma diminuição significativa na área hipocampal e um aumento correspondente na área ventricular de camundongos TMEV em comparação com controles. A análise imuno-histológica pode fornecer informações sobre vários parâmetros, como a presença de células inflamatórias. Neste caso, cortes contendo o hipocampo foram corados com anticorpos para marcar linfócitos T.
Animais infectados simulados não mostram infiltração de células T, enquanto infiltração moderada foi observada na maioria dos camundongos infectados com TMEV. Alguns dos camundongos infectados apresentam infiltração severa de linfócitos T. Nem todos os animais apresentam convulsões durante cada período de observação.
Além disso, a maior incidência de convulsões ocorre nos dias cinco e seis após a inoculação. Usamos o modelo TMEV para testar a eficácia de novos medicamentos anticonvulsivantes contra convulsões induzidas por infecção. Ensaios que investigam alterações comportamentais comórbidas e alterações eletrofisiológicas também podem ser avaliados.
O modelo TMEV forneceu à comunidade de pesquisa em epilepsia o primeiro modelo de epilepsia do lobo temporal induzido por infecção do SNC, permitindo a investigação dos mecanismos subjacentes da epileptogênese após infecção.
