Este trabalho foi financiado pelo NIH HL109478 (KNF). Os autores reconhecem e agradecem Gina Kim e Joann Taylor para a sua assistência em isolar e manter o PASMC na cultura.

O Animal Care Institucional e Comitê de uso da Northwestern University aprovou este protocolo. 1. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Day One <ol><li> Prepare os completos M199 mídia - Misturar 400 ml M199 com 100 ml (concentração final = 20%) de calor FBS inativado e 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina. </li><li> Preparar o soro grátis M199 Media - Misture 500 ml M199 com 5 ml (concentração final = 1%) penicilina / estreptomicina. </li><li> Prepare o PA Agarose - Mix 0,05 g de agarose mais 0,05 g de partículas de ferro em 10 mL estéreis, sem soro M199 mídia. </li><li> Prepare o Lung Agarose - Misturar 0,1 g de agarose em 10 ml estéreis, sem soro M199 mídia. </li><li> Preparar a colagenase - colagenase mistura em estéreis, isentos de soro no meio M199 a uma concentração final de 80 U / ml e, em seguida, esta mistura de filtro estéril. </li&gt; <li> Configure todos os equipamentos antes do tempo antes de eutanásia do mouse. </li><li> Definir PA agarose e pulmão agarose a ferver logo antes de eutanásia do mouse. </li><li> Sacrificá o mouse na jarra com overdose de anestésico isoflurano e ter cuidado para não permitir que o mouse cachorro para entrar em contato com o isoflurano. O melhor rendimento de células é obtido quando as células são colhidas imediatamente após a morte, a fim de evitar os micro-coágulos que se formam na circulação após a morte. </li><li> Remova o mouse do frasco do anestésico, garantir o mouse para o conselho operacional e esterilizar o mouse, instrumentos e luvas com álcool. </li><li> Coloque o bisturi com a lâmina e inciso o mouse desde o pescoço até o abdômen inferior. </li><li> Abra o abdómen do lado esquerdo do rato, expor o rim, e corte da artéria renal, para permitir que o rato para desangrar, evitando assim a formação de coágulos nos pequenos vasos dos pulmões. </li><li> Use a tesoura para cortar ao longo do lado esquerdo do rato deesterno para abrir o tórax. </li><li> Cuidadosamente use bisturi para cortar o diafragma em ambos os lados e abrir completamente a cavidade torácica. Use uma pinça ou pinos para segurar a cavidade torácica aberta. </li><li> Cole a RV com uma agulha 27 G ½ polegada direcionada para o PA e perfundir o RV / PA / pulmões com PBS estéril até os pulmões aparecem em branco (todo o sangue liberado para fora da circulação pulmonar). Isto levará aproximadamente 3-5 ml de PBS, dependendo do tamanho do animal. É importante lavar primeiro a prevenir a formação de coágulos nos vasos pulmonares pequenas. </li><li> Cuidadosamente use dissecção romba para expor a traquéia e um fio por baixo da sutura. </li><li> Coloque os menores fórceps debaixo da traquéia para suporte e coloque o angiocateter G 24 na traquéia. Colocar o angiocateter como se colocando uma IV. </li><li> Fixe o angiocateter na traquéia com sutura enfiada no passo 1.16. </li><li> Leve a ferver PA agarose de água fervente, e inverter para misturar bem. Resfriar o agarosi, a aproximadamente a temperatura do corpo por agitação em gelo. A agarose tem de permanecer em solução, mas não estar tão quente que vai danificar as células do PA. </li><li> Cole a RV com uma agulha 27 G ½ polegada e perfundir o RV / PA / PA pulmões com agarose até os pulmões aparecem na cor cinza. As partículas de ferro na mistura de agarose fará com que os pulmões aparecem na cor cinza. Isto levará aproximadamente 3-5 ml de PA de agarose, dependendo do tamanho do animal. É também importante para ir lentamente como injecção muito rápido pode fazer com que o ferro de vazamento para as vias respiratórias. </li><li> Pegue o pulmão agarose de água fervente e inverta para misturar bem. Em seguida, arrefecer a agarose a aproximadamente a temperatura do corpo por agitação em gelo. A agarose tem de permanecer em solução, mas não estar tão quente que danificam as células do pulmão. </li><li> Elaborar a agarose pulmão e anexar a seringa ao angiocateter G 24 na traquéia. Infundir a agarose através da traquéia para inflar completamente os pulmões. Os pulmões será easier para picar (veja as etapas posteriores) se os pulmões estão adequadamente inflado. </li><li> Remover o bloco de coração-pulmão, e mergulhado em 25 ml de PBS gelado para solidificar a agarose (~ 5 minutos). Use esse tempo para limpar a área cirúrgica. </li><li> Para camundongos recém-nascidos (P7-P21), o melhor rendimento PASMC vem da combinação 2-3 filhotes em um lote de células. PASMC preferem estar em contato com outras células para a saúde celular ideal e crescimento. Se um rato é usado por isolamento, em seguida, as células são muito escasso e não se desenvolvem bem. Ao combinar os animais, colheita e frio os blocos coração-pulmão em conjunto e, em seguida, passar para picar uma vez que todos os blocos coração-pulmão foram retirados dos animais. </li><li> Mover-se para a capa de cultura de células para a esterilidade deste ponto em diante. </li><li> Colocar os pulmões refrigerados na tampa do 10 centímetros prato de cultura de tecidos e remover cuidadosamente o coração, timo, traqueia, e de qualquer tecido conjuntivo a partir dos pulmões. </li><li> Mover os pulmões para a parte inferior do prato de 10 centímetros de tecido de culturae adicionar cerca de 1 ml gelada estéril PBS. </li><li> Picar os pulmões em pedaços muito pequenos (1-2 mm) com dois bisturis. </li><li> Quebrar a ponta fora de uma pipeta de 5 ml sorológica estéril. Pipeta picados lama pulmão em tubo de 50 ml estéril. Utilização adicional estéril PBS gelado para lavar a placa para assegurar que todo o tecido pulmonar entra no tubo de 50 mL cónico. </li><li> Coloque o tubo de 50 ml cônico sobre o ímã. Aguardar o tecido contendo ferro para mover para o lado do tubo ao lado do íman. Dependendo da proporção do navio contendo ferro para tecido pulmonar, alguns dos recipientes pode ainda ser flutuante neste ponto. Aspirar fora da PBS devagar e com cuidado tentando não aspirar o tecido pulmonar flutuante, uma vez que não está claro se ele contém vasos. </li><li> Lava-se a pelete 3x pulmão com 5 ml de PBS estéril, novamente para tentar minimizar a quantidade de tecido do pulmão que é aspirado. </li><li> Ressuspender o sedimento de pulmão em 3 ml de colagenase e despeje em 60 milímetros de tecido prato de cultura. Nãotentar pipeta isso, os pedaços do pulmão vai ficar com o interior de sua pipeta. </li><li> Use um adicional de 3 ml para enxaguar o tubo após o vazamento, e não derramar sobre isso em 60 milímetros de tecido prato de cultura também. </li><li> Colocar em 37 ° C incubadora de cultura de tecido durante 1 hora. </li><li> Pipeta tecido + pasta colagenase cima e para baixo com uma agulha 15 G contundente em uma seringa de 5 ml até que todos os grandes pedaços de pulmão são interrompidas. O tecido + pasta de colagenase será nublado neste momento, sem pedaços de tecido visíveis. </li><li> Despeje em um novo tubo de 50 ml estéril e anexar ao ímã. </li><li> Lava-se a placa de cultura de tecido com cerca de 5 ml de meio M199 completo para assegurar que todo o tecido tenha sido recolhido, e despeje este para dentro do tubo cónico. </li><li> Aspirar fora da colagenase + media sobrenadante. Desta vez, não será muito poucos flutuadores, e um sedimento contendo ferro compacto estará no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de completa media de 3x. Isto é necessário para inactivar a colagenase. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Deite o sedimento ressuspenso em tecido de 35 mm prato de cultura. Utilizando um microscópio, haverá fragmentos pequenos vasos flutuando com partículas de ferro contidos no lúmen do vaso. </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido (denominado placa zero) na incubadora de cultura de tecido durante a noite. As primeiras células que migram para fora da placa de zero a cerca de 50% são fibroblastos e PASMC 50%, com base na coloração para marcadores de músculo liso. Esta placa é chamado de zero chapeado e finalmente descartado após os passos subsequentes de enriquecimento. </li></ol> 2. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Day Two <ol><li> Despeje a mídia sobrenadante de placa de zero em um tubo de 50 ml limpo. </li><li> Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez não haverá quase nenhum floaters, e um compacto de ferro-Containing pelete vai formar no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Esta será uma placa (Figura 1A). </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido. </li></ol> 3. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Seis Dias <ol><li> Despeje a mídia sobrenadante de uma placa em um tubo de 50 ml limpo. Repetindo várias vezes este passo assegura que todas as células do músculo liso residentes na parede do recipiente ter uma oportunidade de migrar para fora de uma placa de cultura celular. Não é um retorno diminuindo com cada etapa ou seja, cada placa irá ter menos e menos células aderir. </li><li&gt; Refeed uma placa com completos M199 mídia, e coloque de volta na cultura de tecidos incubadora. </li><li> Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez, não será quase não flutuantes, e um sedimento contendo ferro compacto irá formar no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Este será duas placas. </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido. </li></ol> 4. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Nove <ol><li> Despeje o sobrenadante mídia da cultura de tecidos prato dois em um tubo de 50 ml limpo. </li><li> Placa refeed dois com completos M199 mídia, e coloque de volta na cultura de tecidosincubadora. </li><li> Aspirar o sobrenadante fora da mídia. Desta vez, não será quase não flutuantes, e um sedimento contendo ferro compacto irá formar no lado do tubo cónico lado do íman. </li><li> Lava-se com 5 ml de meio completo de 3x. </li><li> Adicionar 3 ml de meio completo e misture cima e para baixo algumas vezes para ressuspender o sedimento contendo ferro. </li><li> Despeje em um prato de 35 milímetros de tecido cultura. Usando um microscópio, os fragmentos de pequenos vasos por aí com partículas de ferro contidas no lúmen dos vasos são vistos. Este será o prato três. </li><li> Colocar a placa de cultura de tecido no incubador de cultura de tecido. </li></ol> 5. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Treze <ol><li> Aspirar a mídia fora de placas de 1-3. </li><li> Delicadamente, lave as células com água morna, PBS estéril. </li><li> Adicionar uma película fina de tripsina (~ 0,25-0,5 ml) de tripsina a cada placa trypsinize para fora das células. As células são muito aderente e terão de ser em tripsina no tecido blore incubadora por aproximadamente 10 minutos para retirar a placa. </li><li> Células colheita fora das placas em 5 ml de meio completo em um tubo de 50 ml anexado ao ímã para retirar as partículas de ferro residuais. </li><li> Lava-se cada uma das placas com um adicional de 0,5 ml de meio completo e adicione que os meios para o tubo de 50 ml. </li><li> Desta vez, tomar a mídia sobrenadante (não aspirado), e descartar a partícula pelota de ferro. </li><li> Placa as células em 5 ml de meio M199 completo em um prato de 60 milímetros para ter células confluentes em poucos dias. Alternativamente, placa de células em 10 ml completos M199 mídia em uma placa de 10 cm, e PASMC levará cerca de mais 1-2 semanas para chegar a confluência. </li></ol> 6. Isolamento da artéria pulmonar de ratos neonatos - Dia Quatorze <ol><li> Troque a mídia para novos completos M199 mídia para remover qualquer tripsina residual. Haverá uma população de PASMC fina em placa de cultura de tecido (figura 1B). </li></ol> 7. Cuidados de Rotina <ol><li> Troque a mídia para novos completos M199 media cerca de 2x por semana. </li><li> Ao dividir estas células, cerca de 10 min no incubador por uma película de tripsina (0,25-0,5 ml) é necessária para as células para retirar a placa. Usando o filme tripsina permite repique da PASMC sem girar as células. Se demasiado tripsina é usado, então a PASMC deve ser centrifugado para girar a tripsina, ou as células não readhere à placa. Às vezes, depois de girar as células, é difícil conseguir a PASMC ressuspenso em completa M199 mídia. </li><li> Em observações, o PASMC isolado se comportar como células musculares lisas de forma confiável por 4-5 passagens, mas as células isoladas vai manchar para células musculares lisas marcadores até passagem 7. Contar o primeiro pool 60 milímetros ou 10 centímetros prato no dia treze como passagem 2 (revestimento após a primeira exposição a tripsina). </li></ol>

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	<li>Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+the+pulmonary+vascular+bed+in+fetal+lambs.">Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs.</a> Circulation. 53, 144-151 (1976).</li><li>Walsh-Sukys, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn+in+the+era+before+nitric+oxide:+practice+variation+and+outcomes.">Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes.</a> Pediatrics. 105, 14-20 (2000).</li><li>Khemani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+hypertension+in+formerly+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia:+clinical+features+and+outcomes+in+the+surfactant+era.">Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era.</a> Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).</li><li>Jobe, A. H., Bancalari, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchopulmonary+dysplasia.">Bronchopulmonary dysplasia.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).</li><li>Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+echocardiography+for+the+diagnosis+and+management+of+pulmonary+vascular+disease+in+young+children+with+chronic+lung+disease.">Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease.</a> Pediatrics. 121, 317-325 (2008).</li><li>Check, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+growth+restriction+and+pulmonary+hypertension+in+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia.">Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia.</a> J. Perinatol. , (2013).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+increases+phosphodiesterase+5+expression+and+activity+in+ovine+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 102, 226-233 (2008).</li><li>Aschner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+synthase+gene+transfer+enhances+dilation+of+newborn+piglet+pulmonary+arteries.">Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries.</a> Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).</li><li>Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hypoxia+increases+cytosolic+calcium+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).</li><li>Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+activation+by+hypoxia+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+is+age+and+site+specific.">RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific.</a> Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).</li><li>Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibroblast+growth+factor-2+expression+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+involves+increased+reactive+oxygen+species+generation.">Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).</li><li>Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturational+shift+from+PKCzeta+and+voltage-gated+K++channels+to+RhoA/Rho+kinase+in+pulmonary+vasoconstriction.">Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction.</a> Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).</li><li>Wedgwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+regulates+extracellular+superoxide+dismutase+activity+and+expression+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension.</a> Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+increases+PDE5+activity+in+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).</li><li>Chester, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinaciguat,+a+soluble+guanylate+cyclase+activator,+augments+cGMP+after+oxidative+stress+and+causes+pulmonary+vasodilation+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).</li><li>Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+voltage+gated+potassium+channel+responses+in+a+fetal+lamb+model+of+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).</li><li>Olschewski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+K(Ca)+channel+to+membrane+potential+and+O2+sensitivity+is+decreased+in+an+ovine+PPHN+model.">Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).</li><li>Aslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+lung+injury+in+a+murine+model+of+neonatal+chronic+lung+disease.">Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).</li><li>Balasubramaniam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+angiogenic+cells+restore+lung+alveolar+and+vascular+structure+after+neonatal+hyperoxia+in+infant+mice.">Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+attenuates+pulmonary+inflammation+in+neonatal+lung+injury.">Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury.</a> Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+attenuates+pulmonary+inflammation+and+fibrin+deposition,+mortality+and+right+ventricular+hypertrophy+in+neonatal+hyperoxic+lung+injury.">Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury.</a> Respir. 10, 30 (2009).</li><li>Ladha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+improves+alveolar+growth+and+pulmonary+hypertension+in+hyperoxia-induced+lung+injury.">Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury.</a> Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+hyperoxia+increases+mitochondrial+oxidation+and+increases+phosphodiesterase+5+activity+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106, 526-535 (2010).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Generated+at+Mitochondrial+Complex+III+Triggers+Acute+Responses+to+Hypoxia+in+the+Pulmonary+Circulation.">Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).</li><li>Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+NADPH-oxidase+is+activated+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste artigo, descreve pela primeira vez o isolamento de PASMC de ratinhos em P7, P14 e P21. A fim de realizar isto, uma suspensão de agarose e 0,2 uM partículas de ferro são infundidas através de RV no PA. Devido ao pequeno tamanho das partículas de ferro, que não podem passar através do leito capilar pulmonar e assim, são depositados na pequena PA. Os pulmões são inflados, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para fora da solução usando um imã. Finalmente, os vasos foram plaquead...

A hipertensão pulmonar é normal, durante a vida intra-uterina desde a placenta serve como o principal órgão de troca gasosa e apenas 10% do débito cardíaco é circulado através do leito vascular pulmonar. No útero, as pressões pulmonares são semelhantes às pressões sistémicas devido à resistência vascular pulmonar elevada . A progressão da gestação, há um rápido crescimento da pequena PA dentro do pulmão, preparação do feto para o aumento dramático no fluxo sanguíneo pulmonar que ocorre no momento do nascimento 1. Quando a transição perinatal normal falhar em crianças de curto prazo ea termo, o resultado é a hipertensão pulmonar persistente do recém-nascido (HPP). HPP é uma síndrome clínica causada por diversas patologias subjacentes diferentes. No entanto, todas essas crianças compartilham aspectos fisiopatológicos comuns, tais como elevada resistência vascular pulmonar, hipoxemia e manobras da direita para a esquerda do fluxo de sangue através de conexões fetais persistentes, como a persistência do canal arterial ou paraamen ovale. HPP afeta 2-6 por 1.000 nascidos vivos e transmite um risco de 8-10% de mortalidade, bem como significativa a curto prazo e de longo prazo morbidade 2. Além disso, os nascidos de muito baixo peso ao nascer prematuros podem desenvolver hipertensão pulmonar como conseqüência de sua doença pulmonar subjacente. A doença pulmonar subjacente mais comum dos prematuros é a displasia broncopulmonar (DBP). Não obstante o risco de DBP se correlaciona com a idade gestacional e peso ao nascer, ainda não está claro por que um subconjunto dessas crianças se desenvolve hipertensão pulmonar significativa e como tratar adequadamente essas crianças. Maus resultados, incluindo a internação prolongada e aumento da mortalidade, são comuns 3-6. Historicamente, PASMC fetais ovinos ou PASMC fetal de suíno de animais saudáveis ​​têm sido usados ​​para estudar as vias de sinalização envolvidos na transição vascular pulmonar normal após o nascimento. Estes são tipicamente isoladas a partir de resistência à quinta geração de um PAn ovina e suína feto que é entregue e sacrificados antes de qualquer respiração espontânea 7-9. Além disso, alguns pesquisadores têm isolado e utilizado PASMC de um pouco mais velha e com respiração espontânea cordeiros e leitões em 3 dias, 2 semanas e 4 semanas 10-12. Mais recentemente, alguns grupos isolados e utilizados PASMC isolado cordeiros com HPP para examinar os distúrbios em vias de sinalização no estado de doença 13-17 com sucesso. Estas células têm provado ser uma ferramenta valiosa para examinar as vias de sinalização que são cruciais tanto na vasculatura pulmonar normal e doente a curto prazo e longo prazo. No entanto, eles não dar dicas sobre as vias de sinalização afetadas em prematuros com hipertensão pulmonar. Além disso, não permitir que as possibilidades de manipulação genética observada em modelos do rato da doença. Modelos de ratos e camundongos têm sido muito utilizados para modelar BPD e, mais recentemente, estão sendo usados ​​para hy pulmonar modeloarterial sistêmica resultante do DBP 18-22. Ratos recém-nascidos são atraentes para trabalhar devido ao seu tamanho maior, mas eles também sofrem com a falta de potencial de modificação genética. Animais geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para investigar os efeitos de genes alvos específicos sobre a fisiologia animal inteiro em camundongos recém-nascidos, mas até agora ninguém foi previamente isolada com sucesso PASMC destes pequenos ratos. Ao isolar PASMC, maior informação pode ser obtida sobre como alterar as vias em resposta a estímulos ambientais e / ou a modificação genética específica no músculo liso da artéria pulmonar. Além disso, ao vivo PASMC podem ser visualizados em tempo real para examinar as mudanças rápidas nas principais moléculas sinalizadoras, como cálcio e espécies reativas de oxigênio 23-25. Recentemente, descreveram o isolamento de PASMC de ratinhos adultos utilizando uma variação da técnica de Marshall et al. 26 utilizada para isolar rato PASMC 23,25,26. Temos, agora, adaptado aª estendeu esta técnica para pequenos ratos 7-21 dias de idade (P7, P14 e P21). A principal limitação a esta nova técnica de isolamento PASMC é que requer múltiplos ratinhos para gerar suficientes células para as experiências e as células que crescem muito lentamente, o que é característico de células primárias de músculo liso. Apesar destas limitações, acreditamos que esta técnica para isolar PASMC neonatal mouse irá permitir a maior investigação das vias de sinalização importantes envolvidos no desenvolvimento da hipertensão pulmonar, e representa um avanço significativo nesta matéria.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

A hipertensão pulmonar é uma importante causa de morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Historicamente, tem sido importante estudo das vias de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso vascular em PASMC de feto de ovelha. Enquanto ovelhas fazer um excelente modelo de hipertensão pulmonar prazo, eles são muito caros e não têm a vantagem de manipulação genética encontrada em ratinhos. Por outro lado, a incapacidade de isolar PASMC de ratinhos era uma limitação significativa do referido sistema. Aqui descrevemos o isolamento de culturas primárias de rato PASMC de P7, P14, e P21 ratinhos usando uma variação da técnica descrita anteriormente de Marshall et al. 26 que foi previamente utilizado para isolar PASMC rato. Estes PASMC murino representam uma nova ferramenta para o estudo das vias de sinalização no período neonatal. Resumidamente, uma suspensão de 0,5% (w / v) de agarose + 0,5% de partículas de ferro em meio M199 é infundida no leito vascular pulmonar através do ventrículo direito (VD). Opartículas de ferro são 0,2 m de diâmetro e não pode passar através do leito capilar pulmonar. Assim, as lojas de ferro nas pequenas artérias pulmonares (PA). Os pulmões são inflados com agarose, removido e dissociado. Os vasos que contêm ferro são puxados para baixo com um ímã. Depois de colagenase (80 U / ml) e após dissociação do tratamento, os vasos são colocados numa placa de cultura de tecidos em meio M199 contendo 20% de soro fetal bovino (FBS), e antibióticos (meio completo M199) para permitir a migração de células para o prato de cultura . Esta placa inicial de células é uma mistura de 50-50 de fibroblastos e PASMC. Assim, o puxar para baixo procedimento é repetido várias vezes, para obter uma população mais puro e PASMC remover qualquer ferro residual. Identidade da célula do músculo liso é confirmado por imunocoloração para o bom miosina muscular e desmina.

Durante e após o isolamento, PASMC sejam apreciados por microscopia óptica e por imunocoloração para os marcadores de células musculares lisas. Por microscopia de luz no início do protocolo, PASMC são vistas migrar para o prato de cultura de tecido a partir do pequeno contendo ferro vasos (Figura 1A). Depois partilha placas de um a três no dia treze, então partículas de ferro não são mais vistos como aqueles têm sido puxado para fora na etapa final pooling. Em vez disso, uma população de ...

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

isolation-of-pulmonary-artery-smooth-muscle-cells-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K visualizações.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Biologia

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolamento da Human Umbilical células musculares arteriais (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Medição da proliferação de células musculares vasculares lisas usando química clique

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...