Este protocolo mostra como usar organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologia organ-on-a-chip para gerar um chip intestinal fisiologicamente relevante que pode então ser usado para prever farmacocinéticas e interação droga-droga e para estudar disfunção da barreira epitelial intestinal. A união de organoides na tecnologia organ-on-a-chip nos permite reproduzir a complexidade do epitélio intestinal. Além disso, permite maior controle experimental das pistas mecânicas, distribuição de fluxo e gradientes bioquímicos.
Este método emula a complexa fisiologia do intestino humano, dando uma maior compreensão da base celular e molecular das funções pertestinais normais e patológicas. Isso ajuda a prever melhor a farmacocinética e a farmacodinâmica e potenciais candidatos a medicamentos para evitar danos inflamatórios. A semeadura é um passo crítico no protocolo.
A fragmentação excessiva ou a densidade de semeadura imprecisa dos fragmentos organoides intestinais podem comprometer o desenvolvimento e a diferenciação da barreira epitelial. Para começar, aspire o meio da cultura organoide estática. Recuperar a mídia de poços suficientes para alcançar uma densidade final de semeadura de oito milhões de células por mililitro.
Adicione 500 microliters de solução de dissociação BMM gelada a cada poço e conecte o BMM solubilizado da superfície do poço. Colete a suspensão em um tubo de ligação de baixa proteína de 15 mililitros e coloque-a no gelo. Agite suavemente o tubo a cada 15 minutos por uma hora.
Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter uma pelota organoide. Se uma camada de gel transparente for observada acima da pelota, aspire a solução do tubo. Resuspenda a pelota e adicione um volume igual de solução de dissociação BMM.
Incubar no gelo por 10 minutos e centrífuga. Repita até que não haja resíduos de BMM solubilizados. Em seguida, descarte o supernazio e resuspenque a pelota em dois mililitros de solução de digestão organoide.
Incubar o tubo a 37 graus Celsius por um a três minutos e adicionar oito mililitros de DMEM F12 avançado para parar a reação enzimática. Centrifugar e resuspengar a pelota em meio completo de crescimento organoide para alcançar oito milhões de células por mililitro. Alíquota 360 microliters em tubos de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitros.
Em seguida, remova o meio do canal superior dos chips revestidos e adicione 30 microliters da suspensão celular. Incubar os chips a 37 graus Celsius durante a noite para aderir os fragmentos organoides à membrana. Adicione três mililitros de meio de crescimento organoide completo pré-equilibrado ao reservatório superior de entrada e três mililitros de meio de crescimento de células endoteliais pré-equilibradas no reservatório de entrada inferior.
Adicione 300 microliters da mesma mídia nos respectivos reservatórios de saída superior e inferior. Transfira a bandeja que transporta os módulos portáteis para o módulo de cultura. No módulo de cultura, execute repetidamente o ciclo primo até que gotículas suficientes se formem para conectar com sucesso os chips.
Em seguida, deslize o porta-chips para o módulo portátil. Em seguida, inicie o ciclo de regulação de duas horas para pressurizar a mídia cultural no módulo portátil e chip após o qual as condições programadas serão retomadas. Em seguida, altere as configurações de alongamento e inicie o módulo de cultura.
Após 24 horas, repita o ciclo com 10% de elasticidade e a mesma frequência. Para preparar a mídia de dosagem ou o controle do veículo, diluir as soluções de estoque de indutores CYP ou DMSO em meio de crescimento organoide completo médio e meio de crescimento celular endotelial. Pausa o módulo de cultura e leve as bandejas para o armário de biossegurança.
Substitua a mídia em todos os reservatórios de entrada e saída por dois mililitros de mídia de dosagem por indutores ou controle de veículos. Devolva os módulos portáteis de volta ao módulo de cultura e reinicie o fluxo a 30 microliters por hora. Substitua a mídia por uma solução indutora recém-preparada a cada 24 horas e continue a cultura por 48 a 72 horas.
Em seguida, leve as bandejas para o armário de biossegurança e aspire o meio de dosagem de todos os reservatórios. Lave e substitua o reservatório de entrada superior por médio DMEM F12 avançado e o reservatório inferior por meio de crescimento de células endoteliais. Substitua o meio de lavagem por um mililitro da solução de substrato da sonda.
Perfunda os chips a uma alta vazão de 1.000 microliters por hora durante cinco minutos e aspire tanto os reservatórios de saída superior quanto inferior. Devolva os chips ao módulo de cultura e incubar por uma hora sob um fluxo constante de 300 microliters por hora. Após uma hora de tratamento, pare o fluxo e leve as bandejas para o armário de biossegurança.
Colete 100 microlitres de efluentes do reservatório superior e adicione-o a um tubo contendo 200 microliters de solução stop. Coloque os tubos imediatamente em gelo seco e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius. Lave os dois canais com 200 microliters de DPBS estéreis.
Em seguida, bloqueie a saída inferior do canal com uma ponta de pipeta de filtro de 200 microliter. Perfuse 50 microliters da solução de dissociação através do canal inferior e incubar por dois minutos em temperatura ambiente. Certifique-se de desprendimento completo das células endoteliais e remova a solução de dissociação do canal por pipetação.
Repita a lavagem. Em seguida, bloqueie a tomada superior do canal e peruse 75 microliters de tampão de proteína lysis. Deixe a ponta da pipeta inserida e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.
Colete os lises celulares em um tubo de 1,5 mililitro por tubulação de cinco a dez vezes. Repita a perfusão e a coleta para obter o descolamento completo das células e armazene os lises a menos 80 graus Celsius até a análise. Para lise RNA, siga o mesmo procedimento ao usar 150 microliters de tampão de RNA lysis.
Primeiro, prepare uma solução de dosagem de gama de interferon diluindo as soluções de estoque no meio de crescimento celular endotelial desgaseado. No gabinete de biossegurança, remova o meio dos reservatórios de entrada do canal inferior e substitua-o por três mililitros da solução de dosagem diariamente. Em seguida, coloque as bandejas no módulo de cultura e perfunda os chips a uma alta taxa de fluxo de 1.000 microliters por hora durante cinco minutos.
Mude a vazão para 60 microliters por hora e continue a cultura fluidica. Adicione 100 microliters de DPBS por poço em uma placa murada 96-bem preta. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitres do efluente de todos os reservatórios aos respectivos poços.
Para preparar uma curva padrão, realize uma diluição três vezes do meio contendo 100 microgramas por mililitro de três kilodalton dextran cascata azul em DPBS. Em seguida, realize delírios seriais usando uma diluição tripla do meio de crescimento celular endotelial em DPBS. Características morfológicas distintas do duodeno e chips de cólon foram destacadas pela presença das formações semelhantes a villi no chip duodeno representando a arquitetura do intestino delgado.
No chip de duodeno exposto aos indutores citocromo P450 rifampicina e vitamina D3, houve uma expressão genética mRNA elevada para a droga metabolizadora enzimática citocromo P450 3A4 e atividade catalítica aprimorada da enzima citocromo P450, indicando respostas apropriadas de indução em todos os três doadores organoides. Ao tratar a monocamada epitelial do chip de cólon com interferon gama, foram observadas morfologia celular comprometida e perda do epitélio colunaar. Além disso, o tratamento com interferon gama levou ao aumento do sinal citoplasmical de proteínas de junção apertadas e aderentes em relação ao controle do veículo, mostrando o deslocamento dos marcadores de junção apertados ZO-1 e Claudin 4 e a internalização do occludin e E-cadherin.
Observou-se aumento significativo da permeabilidade epitelial paracelular após 48 horas de estimulação gama de interferon em lascas de cólon. Da mesma forma, o interferon gama induz a ativação da apoptose indicada pelo aumento do conteúdo intracelular do Caspase 3. Interferon gama induziu uma secreção polarizada de moléculas pró-inflamatórias no chip de cólon, como mostrado pela secreção basolateral de VCAM-1 e interleucina-6 e a secreção apical do ICAM-1 e da proteína amiloide do soro A.Para uma cultura bem sucedida de chip intestinal, deve-se utilizar organoides indiferenciados e seguir as instruções de fragmentação e densidade de semeadura.
Após o estabelecimento bem-sucedido do chip intestinal, podemos estudar absorção intestinal, transporte e metabolismo, níveis de nutrientes e secreção hormonal intestinal, interações de patógenos de micróbios hospedeiros, segurança e eficácia medicamentosa, mecanismos de doença específicos do paciente e respostas a terapias.
