Este protocolo descreve o primeiro modelo apical-out em um prato e é uma melhoria crítica sobre modelos enteroid lateral basal em um prato ao estabelecer modelagem in vitro de potenciais terapêuticas destinadas à administração oral. Este método permite o acesso à superfície apical de enteróides. Os compostos podem ser adicionados à mídia celular e os compostos são tomados apicamente como seriam in vivo.
Pesquisadores interessados em estabelecer um sistema in vitro de inflamação intestinal para testar potenciais terapêuticas orais podem achar essa técnica especialmente útil. Tecidos provenientes de diferentes idades e espécies podem exigir maior padronização. Assim, pacientes ao estabelecer tempos de reversão de polaridade podem ser necessários.
Para reverter a polaridade dos enteroids 3D aspiram a mídia de cada poço de uma placa de 24 poços de enteróides basolaterais 3D estabelecidos. Adicione 500 microliters de cinco mililitros de gelo frio, EDTA ou PBS a cada poço de uma placa de 24 poços e interrompa suavemente o extrato da membrana do porão ou a cúpula da matriz extracelular, pipeta para cima e para baixo cinco a seis vezes com uma pipeta P 200. Transfira o conteúdo de quatro poços para um tubo narrado de 15 mililitros.
Em seguida, adicione oito mililitros de EDTA fria cortar PBS ao tubo. Transfira os 20 poços restantes da mesma forma. Incubar os tubos a quatro graus Celsius por uma hora em uma plataforma rotativa ou agitar a 330 RPM.
Após a incubação centrifugar os tubos e descartar o sobrenatante de cada tubo. Combine e lave as pelotas com cinco mililitros de DMEM F12. Em seguida, centrifuse a suspensão das células e remova o sobrenatário antes de adicionar 12 mililitros de meio livre de antibióticos ao tubo, garantindo que as pelotas celulares sejam resuspendidas.
Pippet 500 microliters da suspensão enteróide em cada poço de uma placa de fixação 24 bem ultra-baixa. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a cinco dias ou até que as enteroids tenham invertido a polaridade. No primeiro dia, transfira o conteúdo de quatro poços de uma placa de poço de 24 para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro.
Repita para todos os poços desejados a cada tratamento em um tubo separado. Centrifugar os tubos e resuspensar a pelota em 300 microliters de 4% de fixação de aldeído à temperatura ambiente. Após 30 minutos lave as pelotas com 500 microliters de PBS.
Adicione 500 microliters de 0,1%Triton X 100 aos tubos. Incubar os tubos por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, coloque os tubos em um rotador ou agitador a 200 RPM por 15 minutos a dois a oito graus Celsius.
Após a última incubação, adicione 500 microliters de 10% NDS em PBS T e incubar em temperatura ambiente por 45 minutos. Durante a incubação, prepare a solução primária de anticorpos. No dia seguinte, adicione 250 a 500 microliters PBS T aos tubos, dependendo do tamanho da pelota, e coloque-os no rotador ou shaker a 200 RPM por uma hora a dois a oito graus Celsius.
Adicione 200 microliters da solução secundária de anticorpos e incubar os tubos a dois a oito graus Celsius no escuro. No dia seguinte, prossiga para a montagem de enteróides apical manchados girando os tubos e removendo 100 microliters de supernascer. Resuspenja as células nos 100 microlitadores restantes de supernadante e transfira a suspensão celular para tubos de 500 microliteres.
Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 segundos. Remova o supernatante e resuspenja as pelotas em 100 microliters de temperatura ambiente muito vermelha mancha de ácido nucleico. Após 20 minutos de incubação, centrifugar as células e resuspensar as pelotas em 100 microlitres de PBS.
Após a segunda lavagem e centrifugação remova 70 microlitadores do supernatante e resuspenja as pelotas no volume restante de PBS. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um deslizamento de cobertura de 24 por 60 milímetros. Aplique 75 microliters de montagem diretamente na amostra e remova quaisquer bolhas com uma ponta de pipeta.
Depois de curar durante a noite no escuro, aplique uma fina camada de glicerol nos deslizamentos da tampa, em seguida, monte os deslizes de cobertura sobre o slide de vidro e pressione-o suavemente no lugar. Toque para remover quaisquer bolhas entre o deslizamento da tampa e o slide. Deixe que o deslizamento da tampa se estafina à temperatura ambiente no escuro por duas horas antes de imaginar os enteróides em 20 vezes a ampliação com um microscópio confocal.
Para tratamentos enteróides, estabeleça uma enterocolite necrosante apical em um modelo de prato por 24 horas, conforme descrito no manuscrito do texto. Antes de realizar o ensaio, remova 100 microliters de mídia de cada poço deixando os 400 microliters restantes. Adicione 400 microliters de reagente de ensaio de viabilidade celular a cada poço.
Misture vigorosamente o conteúdo em um agitador de placas por cinco minutos a 200 RPM para induzir a lise celular. Em seguida, transfira 200 microliters para um único poço de uma placa de fundo 96 bem clara. Repita para os 600 microliters restantes criando quatro réplicas técnicas por poço.
Utilizando um leitor de placas capaz de luminescência, registos de integração de 0,25 milissegundos e compare os valores relativos entre os tratamentos. A coloração representativa da imunofluorescência de controle confirmou a localização apical dos núcleos em direção ao lúmen e a detecção de vilão na borda externa do epitélio. Em comparação com o controle, a exposição à lipo polissacarídeo, necrose tumoral alfa, ou hipoxia por si só não induziu alterações expostas na morfologia celular bruta E-cadherina ou localização de vilão ou intensidade fluorescente.
O tratamento com polissacarídeo lipo ou tumor necrose alfa em combinação com a arquitetura epitelial interrompida por hipóxia e demonstrou uma perda significativa de junção de adesão e expressão de proteína de borda de escova revelada pela perda da audição do ECA e da coloração do vilão. A viabilidade celular apical foi determinada sob condições normóxicas ou hipoxicas. Sob condições normóxicas em comparação com o controle lipo polissacarídeo ou necrose tumoral alfa não afetou significativamente a viabilidade celular dos enteróides.
No entanto, reduções significativas na viabilidade foram observadas em lipo polissacarídeo ou necrose tumoral alfa em combinação com hipóxia em comparação apenas com hipóxia. Ao mesmo tempo em que estabelece apical fora em um modelo de prato. Lembre-se de manter edta no gelo de suspensão celular frio.
Isso aumentará a reversão da polaridade e garantirá que todo o ECM seja devidamente liquefeito e removido. Outras aplicações a jusante, como QPCR, RNA-seq, manchas ocidentais ou avaliações funcionais de permeabilidade de barreira podem ser realizadas ainda mais para caracterizar a resposta à sinalização inflamatória na hipóxia.
