Nosso protocolo permite que os pesquisadores construam motivos citoesqueléticos a partir de componentes purificados e meçam diretamente as forças que essas redes geram para entender como esses componentes mecânicos da célula funcionam em estados saudáveis e de doença. Este método nos permite quantificar forças e correlacionar esses números diretamente para manter os parâmetros das proteínas envolvidas, incluindo a concentração e a densidade das proteínas. Parâmetros que geralmente são impossíveis de adquirir dentro da célula.
Este método pode fornecer insights sobre qualquer tipo de rede de citoesqueleto, como aqueles envolvidos na mitose ou desenvolvimento neural. Ele pode ser prontamente adaptado para estudar redes envolvidas na contração muscular ou migração celular, simplesmente trocando essas proteínas específicas que estão sendo usadas. O aspecto mais complicado deste método é a coordenação das diferentes tecnologias, que incluem uma armadilha óptica de feixe único e um microscópio TIRF.
Além disso, experimentos de molécula única exigem uma preparação cuidadosa de superfícies, como o deslizamento da cobertura, portanto, a preparação de amostras de alta qualidade é primordial. Comece com a construção de uma câmara de umidade colocando um tecido dobrado e sem fiapos umedecido com água ultrapura no fundo de uma caixa de ponta de pipeta vazia. Introduza todos os reagentes pipetando o líquido em uma extremidade do canal e absorvendo o líquido na extremidade oposta.
Usando uma ponta de pipeta de ângulo de 20 microlitros, flua lentamente em 10 microlitros de 0,5 miligramas por mililitro de estreptavidina ou NeutrAvidin. Incubar a lâmina na câmara de humidade durante 4 minutos com a tampa virada para baixo. Limpe a câmara usando 20 microlitros de um BRB80 1x usando um tecido sem fiapos para extrair líquidos.
Depois de repetir os reagentes que fluem e incubação mais uma vez, lave a etapa com 10 microlitros de 0,5 miligramas por mililitro de solução bloqueadora de caseína. Despeje 10 microlitros de microtúbulos biotinilados vermelho-distantes diluídos para a câmara e, em seguida, lave a câmara com 20 microlitros de 1x BRB80. Depois de fluir o reagente e incubar como demonstrado anteriormente, lavar a etapa com 10 microlitros de uma concentração apropriada de proteína não motora a ser estudada, em seguida, fluir em 10 microlitros de microtúbulos de rodamina e repetir a incubação e lavagem.
Em seguida, combine 1 microlitro de contas revestidas de quinesina de rigor e 19 microlitros de tampão de reação. Sele ambas as bordas da câmara com esmalte transparente e espere até que o esmalte seque. Empregar um instrumento de microscópio invertido que tenha recursos de imagem de fluorescência de reflexão interna total e no qual uma armadilha óptica de feixe único tenha sido construída.
Adicionar 1 gota de óleo de imersão na folha de cobertura da câmara de amostragem. Com o lado deslizante da tampa da câmara de amostra voltado para baixo, coloque a amostra a ser fotografada na plataforma do microscópio. Lentamente, traga a objetiva para cima para que haja contato entre o deslizamento da tampa e a objetiva através do óleo.
Ajuste a altura objetiva de modo que a superfície de deslizamento da tampa da câmara de amostra esteja em foco. Grave imagens de quadro único das amostras em todos os três canais. Para os experimentos aqui, use de 100 a 200 milissegundos de exposição.
Ajuste a potência do laser para obter uma boa relação sinal-ruído das amostras, minimizando o branqueamento de fotos em 2 a 5 minutos quando o feixe individual for ensaiado. A frequência de feixes de microtúbulos por campo de visão deve ser de aproximadamente três a quatro feixes de microtúbulos por 100 microlitros por campo de visão de 100 microlitros por câmara. Observe a densidade de contas na amostra usando um campo brilhante e a objetiva de 100x no microscópio.
Empregar uma concentração de contas de tal forma que as contas estejam a um mínimo de 10 micrômetros uma da outra, em média, e garantir que elas estejam livres de qualquer tipo de confinamento ou agrupamento de superfície. Certifique-se de que os microtúbulos vermelhos distantes biotinilados estejam firmemente presos à superfície da tampa deslizem e que a rodamina sem movimento browniano visível. Certifique-se de que os microtúbulos de rodamina estão ligados aos microtúbulos biotinilados através do mapa de reticulação e estão visivelmente flutuando em suas extremidades livres.
Identifique um feixe de microtúbulos adequado que contenha apenas dois microtúbulos, um biotinilado com fixação de superfície completa e um microtúbulo não biotinilado que esteja parcialmente livre em solução e alinhado no eixo x ou y. Use a armadilha óptica para capturar um grânulo livre demonstrando o movimento browniano. Uma vez que o talão tenha sido preso, mova cuidadosamente o talão para o feixe de microtúbulos selecionado, garantindo que nenhum outro grânulo seja puxado para a armadilha no processo.
Certifique-se de que o talão esteja a vários mícrons de distância da região de sobreposição contendo proteínas de reticulação. Abaixe cuidadosamente o talão no eixo z até que ele entre em contato com a borda do segmento livre do microtúbulo de rodamina. Puxe para cima suavemente e mova-se perpendicularmente ao eixo dos microtúbulos para verificar a fixação, observando a flexão do microtúbulo de rodamina e seguindo a posição do talão.
Realinhe cuidadosamente o microtúbulo de rodamina ao longo do eixo do microtúbulo ligado à superfície, movendo o estágio de nanoposicionamento e configure os parâmetros para a tração automatizada do feixe de microtúbulos. Defina a direção ao longo do eixo paralelo dos microtúbulos. Defina a velocidade de tração desejada e o tempo de tração desejado, dependendo do comprimento de sobreposição.
Comece a gravar dados de fluorescência nos três canais a uma taxa de 1 a 2 quadros por segundo. Use os poderes otimizados do laser e os tempos de exposição. Inicie o movimento automatizado do palco e registre os dados de aprisionamento do estágio do detector sensível à posição e do estágio da câmera de fluorescência de reflexão interna total.
Desative as armadilhas para liberar o talão e repita o experimento conforme desejado. Conjuntos da proteína motora mitótica essencial cinesina-5 podem regular o deslizamento dos microtúbulos, gerando forças de empurrar e frear que escalam linearmente com comprimento de sobreposição. Verificou-se que o domínio da cauda do terminal C é necessário para a reticulação eficiente e a geração de força.
A proteína de comprimento total é capaz de gerar forças sustentadas que se estabilizam quando todas as proteínas motoras atingem sua força de estol individual. No entanto, o motor cinesina-5 sem sua cauda C-terminal gera forças máximas que são quase cinco vezes menores em magnitude. Conjuntos da proteína mitótica não motora PRC1 operam como uma cápsula de traço mecânico para resistir ao deslizamento de microtúbulos na zona intermediária do fuso anáfase.
As forças resistivas não dependem do comprimento das regiões de sobreposição entre os pares de microtúbulos ou da densidade local do reticulante, mas dependem fortemente da concentração total de moléculas PRC1 engajadas. Este método pode ser adaptado para estudar diversos sistemas biológicos, como organização microbiana e neurônios, usando proteínas alternativas. Também pode ser facilmente expandido para analisar geometrias de rede baseadas em actina para estudar a contração muscular ou a motilidade celular.
Esta técnica permite estudar geometrias totais celulares únicas, onde os filamentos são tanto de esteira quanto de carga e são organizados por pequenos conjuntos de proteínas. Essas geometrias imitam melhor o que está acontecendo nas células durante inúmeros processos biológicos.
