As matrizes de microtúbulos celulares contêm subpopulações de microtúbulos com propriedades dinâmicas distintas, conforme necessário para a função. Este protocolo aborda como a atividade coletiva dos reguladores concede subpopulações proximais de microtúbulos com propriedades distintas. Este ensaio de restituição de baixo para cima nos permite visualizar simultaneamente a organização e a dinâmica das populações proximais de microtúbulos, como microtúbulos e pacotes únicos, e decifrar os mecanismos subjacentes à sua auto-organização.
A reconstituição multicomponimento requer a otimização de parâmetros experimentais como pH, força iônica e concentração de proteínas, preservando a atividade de cada um. A análise sistemática de componentes individuais antes dos ensaios multifismes é extremamente útil. Para começar, pipeta uma mistura de 4,5 microlitros de BRB ADDTT em um microliter de solução de microtúbulo em um slide de microscópio.
Cubra com uma tampa de 18 por 18 milímetros e sele as bordas com esmalte transparente ou selante VALAP. Posicione o objetivo da TIRF abaixo do deslizamento de cobertura. Visualize os microtúbulos recém-polimerizados em um comprimento de onda apropriado para a tubulina fluorescentemente rotulada na mistura brilhante para determinar que diluição de microtúbulos devem ser usados nos próximos experimentos.
Determine a intensidade do laser para o experimento empiricamente de tal forma que todas as proteínas fluorescentes sejam iluminadas, mas não submetam fotobleaching significativo ao longo do tempo do experimento. Defina a temperatura do microscópio para 28 graus Celsius para visualizar microtúbulos dinâmicos. Use papel de lente para limpar um objetivo de 100X com 70% de etanol.
Use a melhor combinação de cubos de filtro e filtros de emissão, dependendo dos canais fluorescentes a serem imagens. Configure a sequência de imagens. Para um experimento com microtúbulos biotinídos biotinilados rotulados por 647 nanômetros, 560 nanometros de microtúbulos não biotinilados rotulados em tubulina solúvel, e proteína de interesse rotulada por GFP, imagem dos canais de 488 nanômetros, 560 nanômetros e 647 nanômetros a cada 10 segundos por 20 minutos.
Para capturar uma imagem de referência de feixes antes da adição de tubulina solúvel e proteína associada a microtúbulos, configure uma sequência com uma imagem cada em 560 nanômetros e 647 canais de comprimento de onda de nanômetros. Verifique a posição do raio laser no teto acima do microscópio e faça alterações no feixe usando software. Certifique-se de que o iluminador a laser esteja alinhado.
Antes da imagem, adicione uma gota de óleo de imersão de microscópio ao objetivo. Prepare a mistura de tubulina solúvel enquanto a mantém no gelo e gire a mistura. Para imobilizar microtúbulos via linkagem biotina-NeutrAvidin-biotina, primeiro fluxo em aproximadamente 7,5 microliters de solução NeutrAvidin até que a câmara seja preenchida e incubada por cinco minutos.
Lave com 10 microliters de MB frio. Flua em 7,5 microliters da proteína de bloqueio KC e incubar por dois minutos. Lave com 10 microliters de MB quentes para preparar a câmara para a introdução de microtúbulos.
Diluir o estoque de microtúbulos biotinínilcos no BRB ADDTT e adicionar um microliter desta diluição a nove microlitrais de MB quente. Escoar a mistura na câmara e incubar por 10 minutos. Lave microtúbulos não imobilizados com 10 microlitres de MB quentes.
Flua 7,5 microliters de KC quente na câmara e incubar por dois minutos. Durante a incubação, prepare uma solução de dois nanomolars do crosslink ou proteína PRC1 em KC e gire a solução. Flua 10 microliters desta solução para a câmara de imagem e incubar por cinco minutos.
Para fazer pacotes, flua 10 microliters de microtúbulos não biotinilados na câmara e incubar por 10 minutos. Lave a câmara duas vezes com 10 microliters de MB quente. Durante o período de incubação de 10 minutos, prepare 10 microliters de mistura de ensaio contendo proteínas de interesse, tubulina solúvel, nucleotídeos, catadores de oxigênio e antioxidantes e gire-o para baixo.
Mantenha a mistura no gelo. Carregue a câmara de imagem preparada colada no suporte de slides no objetivo 100X TIRF. Use os canais de 560 nanômetros e 647 nanômetros para encontrar um campo de visão que contenha um número e densidade ideal de microtúbulos e feixes únicos.
Uma vez identificado um campo de visão, pegue uma imagem de referência. Flua cuidadosamente na mistura de ensaios sem perturbar a câmara de imagem. Sele as extremidades abertas da câmara com selante VALAP.
Observe os microtúbulos e inicie a sequência de imagens. Após a imobilização de sementes de microtúbulos e os feixes geradores, foram obtidas imagens de fluorescência. Microtúbulos únicos foram identificados por sinal fluorescente no canal de 647 nanômetros, enquanto microtúbulos foram identificados como feixes pré-formados quando exibiam sinais fluorescentes em ambos os canais.
A dinâmica dos microtúbulos únicos e dos feixes crosslinked prC1 foram estudadas na presença das proteínas KIF4A e CLASP1, que revelaram que os microtúbulos únicos se alongam ao longo do ensaio, enquanto o crescimento de microtúbulos interligados está parado. Tenha cuidado para manter os microtúbulos polimerizados a temperatura ambiente ou acima. Mantenha a tubulina solúvel no gelo e proteja a câmara de imagem e microtúbulos e proteínas fluorescentes da luz.
Esses ensaios forneceram uma visão mecanicista de como um módulo proteico encontrado no fuso mitotístico poderia regular diferencialmente a dinâmica de duas populações diferentes de microtúbulos que coexistem no fuso.
