Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia conceder # EB003307 e pela National Science Foundation Prémio Carreira para AF

Projeto de dispositivos microfluídicos usando CorelDraw ou o software AutoCAD Princípio da PDMS microválvulas dispositivos baseados: Os dispositivos consistem em três camadas: uma camada fluídica contendo microchambers de vários tamanhos, uma &quot;camada de controle&quot;, contendo os microcanais necessário accionar o caminho fluídico com microválvulas, e um meio de membranas PDMS fina que é obrigado para a camada de controle. Em repouso, devido ao cumprimento e hidrofobicidade de PDMS, os selos de membrana (reversível) contra sua sede, portanto, as câmaras permanecem isolados uns dos outros, sem entrada de energia. Válvulas pode ser aberto através da aplicação de pressão negativa (por exemplo, o vácuo casa), de modo a membrana PDMS desvia para baixo e se separa da superfície que suporta a parede entre duas câmaras fluídico, ligando assim o caminho fluídico. Fechamento da válvula pode ser conseguido mediante a substituição do ajuste de pressão de vácuo à pressão atmosférica. Fluídico camada e padrões de camada de controle foram projetados usando CorelDraw ou software AutoCAD. Máscaras contendo estes projetos foram impressas em alta resolução (8.000 a 20.000 dpi) em filmes de transparência por meio de serviços comerciais (CAD / Art serviços, Bandon, OR) (máscaras não mostrados). Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão <ol><li> Padrão SU-8 métodos de fotolitografia foram usados ​​para criar SU-8 &quot;mestres&quot; (SU-8 2050, Microchem, Newton, MA) para a camada de microfluídica ea camada de controle de válvula em uma sala limpa (não mostrado neste vídeo). </li><li> Para facilitar a libertação, antes PDMS replicação do SU-8, mestres foram silanizadas por exposição a vapor de um fluorosilane ((tridecafluoro-1, 1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (TFOCS)), em um dessecador jar (sem secagem pellets) ligado a uma fonte de vácuo. A câmara de secador deve ser localizado dentro de um devido Cobertura de vapores químicos à natureza corrosiva dos vapores TFOCS. </li><li> Coloque uma pequena porção de toalha de papel absorvente no interior da câmara exsicador. Adicionar uma gota de TFOCS para a toalha de papel e evacuar o ar da câmara. Aplicar vácuo durante 1 min e desligue. Fechar o vácuo e aguarde 30 min para a deposição. Mantenha os mestres em recipientes fechados para uso futuro. </li></ol> Moldagem réplica de PDMS com os mestres <ol><li> A camada fluídica ea camada de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 mestres. </li><li> PDMS misturar completamente pré-polímero e cross-linker (10:01 em peso. Ratio), de bolha em um dessecador por 10-15 min até que as bolhas claras. </li><li> Corte o tubo de silicone em 1-2 pedaços cm de comprimento. Escolha o tamanho adequado do tubo de acordo com a aplicação. Usamos tubos 1,14 mm ID aqui para fácil conexão a 1 / 16 de polegada da tubagem mais tarde. </li><li> Use Duco Cimento ® para tubos de cola para as regiões de entrada do mestre SU-8 da camada de controle. Tenha cuidado para não usar cola demais, como o tubo de silicone é feita dos mesmos componentes como PDMS, eo tubo será encaixado no dispositivo micro PDMS, criando entradas de ar e fluídico tight / outlets. </li><li> Em nosso dispositivo, as regiões de entrada são projetados sobre as máscaras de ambos fluídico e as camadas de controle, mas as entradas tubo de silicone são moldados apenas em uma camada (por exemplo, a camada de controle) do dispositivo. Para criar entradas para a camada fluídica, que remover manualmente ou perfure a algumas seções da membrana que cobre as regiões de entrada. Portanto, após o alinhamento e montagem, todos os microcanais (aqueles que carregam o fluxo, bem como aqueles que controlam as válvulas) são acessíveis a partir do topo do dispositivo de modo que a superfície inferior é plana, permitindo que imagens do dispositivo em um palco microscópio convencional. </li><li> Com cuidado, despeje de-bolhas PDMS em ambos os mestres, ao redor da tubulação no controle mestre-camada. De-bolha novamente num exsicador. Depois de borbulhar é completa, colocado em 65 ° C para o forno&gt; 1 hora para a cura. </li><li> Remover curado PDMS coberto mestres do forno. </li><li> Corte dispositivos individuais com os mestres (cada mestre contém três dispositivos idênticos) e off casca. </li><li> Remover cola das regiões de entrada com uma agulha ou um par de fórceps. </li><li> Tome o controle da camada PDMS na sala limpa. </li></ol> Manufacturing fina membrana PDMS <ol><li> Como mostrado no princípio dispositivo, a camada do meio consiste em uma membrana de PDMS ~ 12 m de espessura. </li><li> Mix 10:01 wt. relação de pré-polímero PDMS / mistura agente de cura com hexano (3:1 em peso. ratio) em vortex. </li><li> Mover-se em uma sala limpa. (Um ambiente livre de poeira é fundamental para garantir que as membranas PDMS são livres de defeitos; partículas de pó pode resultar em membranas contendo furos e / ou incorrectamente ligado ao molde de réplicas.) </li><li> Coloque um silanizadas 3 wafer polegadas de diâmetro empara o vácuo de um mandril giratório Solitec. A bolacha tem que ser silanizadas (derivatizado com fluorosilane) antes de PDMS de giro para facilitar a liberação de PDMS de superfícies de silício. A tigela Teflon fora do chuck foi embrulhado com filme plástico para facilitar a limpeza. </li><li> Dispense 2-3 ml de PDMS / Hexano mistura para o wafer usando uma agulha de seringa de calibre 18 (para minimizar bolhas). </li><li> Definir os parâmetros de rotação. Giram a 7000 rpm por 30 segundos, resultando em um filme de PDMS de espessura ~ M 12. </li><li> Aqueça o wafer de 85 ° C por 4 min em uma chapa quente para curar o filme PDMS. </li></ol> Ligação de dispositivos multicamadas PDMS e montagem <ol><li> Coloque a camada de controle ea membrana PDMS em uma câmara de plasma de oxigênio. Ligue plasma por 30 segundos (pressão de oxigênio 30 psi, taxa de fluxo 05/03 SCFH, 550W). Traga a camada de controle em contato com a membrana PDMS imediatamente (dentro de 5 minutos) após a ativação de oxigênio. Parâmetros do sistema, tais como a pressão de oxigênio, taxa de fluxo, e poder de plasma e tempo de tratamento, são empiricamente configurado de acordo com diferentes aplicações. </li><li> Aguarde 5 min, e remover a camada de controle do wafer, juntamente com a membrana. </li><li> Remover membranas nas áreas entradas de modo que tanto o controle e camadas fluídicas são acessíveis a partir do topo através da tubulação. </li><li> Alinhar a camada de controle (com tubos de entradas) com a camada fluídica (planar), sob um estereoscópio. Porque PDMS selos em PDMS, sem vínculo permanente é necessária. </li></ol> Controlado por computador abertura e fechamento de microválvulas PDMS por vácuo ou pressão <ol><li> Após o alinhamento e montagem do dispositivo, insira 16/01 OD polegadas (1 / 32 polegadas ID) tubulação de Tygon para o 1,14 milímetros entradas de silicone ID e conectar as entradas para as fontes de pressão ou dos reservatórios de fluidos. </li><li> Para abrir e fechar válvulas, as pressões são controladas por uma linha de vácuo e uma linha de pressão de ar conectado através de dois reguladores de pressão para uma série de miniaturas de válvulas solenóide de três vias. </li><li> As válvulas solenóides são conectados a National Instruments hardware de aquisição de dados controlado via software Labview. </li><li> Operação do dispositivo e deflexão da membrana são visualizados com uma cor câmera CCD (SPOT RT, Instrumentos de Diagnóstico, Sterling Heights, MI). </li></ol> Paralelamente mistura de dois corantes de cores diferentes em diferentes volumes nanolitros definido Nós demonstrar o funcionamento de um misturador paralela que permite o armazenamento e mistura precisa sub-nanolitros volumes de soluções aquosas em vários índices de mistura: <ol><li> A camada fluídica contém duas matrizes de microchambers: Junto série A, o tamanho do microchambers diminui, a partir da esquerda, de 200 mM x 400 m para 200 mM x 40 mm; A 10 é uma câmara de 500 mm x 40 e M é usado apenas para conexão fluídica na matriz A; à direita da câmara A 10 é um conjunto de câmaras simetricamente aumentando em tamanhos. As câmaras em série B são projetados de tal forma que o volume adicionado de quaisquer duas câmaras adjacentes em diferentes linhas sempre igual. A 0, A e B 10r 0r 10, B são concebidos como respectivos controles para as soluções A e B sem se misturar. </li><li> A camada de controle tem dois de forma independente, controlado conjuntos de válvulas. Um conjunto de válvulas {V 1} é usado para conectar dois arrays de câmara com suas respectivas entradas, enquanto que um segundo conjunto de válvulas {2} V é usado para conectar cada par de câmaras nas duas matrizes. </li><li> Preencher o microchambers abrindo conjunto de válvula V {1} para permitir o fluxo de duas soluções de corante para matrizes A e B, respectivamente. Fluxo das soluções pode ser alcançado manualmente ou por vácuo puxando controlada com válvulas solenóides. Se bolhas de ar na forma microchambers, mais solução pode ser empurrado para remover as bolhas ou o dispositivo pode ser deixado por alguns minutos e bolhas vão desaparecer devido à permeabilidade ao ar de PDMS. </li><li> Fechar o conjunto da válvula V {1} para isolar cada câmara em ambos os arrays. </li><li> Conjunto de válvula aberta {2} V para permitir que fluidos mistura entre as câmaras adjacentes em diferentes arranjos. Mistura só leva ~ 1-2 min para completar para estes volumes. </li><li> Fechar {2} V para empurrar o líquido de volta para cada câmara fluídico e câmaras deformar volta à sua forma original. Uma vez que as duas matrizes fluídicos são projetados com câmaras de 11 tamanhos diferentes, 11 diferentes relações de mistura são produzidos em uma única etapa de mistura. </li></ol> Um sistema integrado microfluídicos para perfusão controlada por computador de culturas de células microfluídicos Demonstramos um sistema microfluídicos que é capaz de a perfusão automatizada de múltiplas soluções para uma única câmara de cultura de células. Oentradas são controladas por microválvulas, que pode ser ativado em qualquer seqüência de entradas individuais, várias combinações, ou todos de uma vez. O dispositivo é capaz de produzir gradientes ou misturas das várias soluções. Este dispositivo também é composto por três camadas: uma camada fluídica, uma camada de controle, e um meio de membranas PDMS fina. Alternativa etapas de fabricação para este dispositivo: <ol><li> As portas de entrada para os canais fluídicos e canais de controle são &quot;perfurados&quot;, usando de 1,2 mm de diâmetro Harris Micro-Punch (Ted Pella, Inc.). A tubulação é conectado às entradas usando blunted 18 agulhas que são inseridas no para o PDMS através da camada de controle. Isto permite uma embalagem mais densa de entradas do que o tubo de silicone. A conformidade do PDMS fornece uma perfeita vedação em torno do agulhas para efetivamente entregar fluido ou pressão pneumática. </li><li> Conforme descrito anteriormente, a ligação da membrana PDMS fina para a camada de controle é realizado utilizando a exposição ao plasma de oxigênio. </li><li> A camada fluídica é preparado por moldagem réplica com PDMS pré-polímero e cross-linker na proporção de 5:1 e parcialmente curar por 25 minutos a 60 ° C em um forno de convecção. Neste ponto, a camada parcialmente curado fluídico ainda é brega, mas pode ser removido do mestre. </li><li> A camada fluídica é manualmente alinhado com o controle pré-montados e camadas de membrana utilizando um estereoscópio. O dispositivo montado é então colocado numa placa de aquecimento durante 5 minutos a 80 º C. Em seguida, as linhas de controle de válvula são conectados ao controlador automatizado e as válvulas são acionadas até a membrana separa da camada fluídica em todas as sedes de válvulas através da aplicação de vácuo. Depois de &quot;desmontar&quot; as válvulas, o controlador de computador está definido para o ciclo de válvulas e fora enquanto o dispositivo é ainda mais curado sobre a placa de aquecimento a 80 º C durante pelo menos 1 hora. </li></ol> As características de nosso sistema integrado microfluídicos: O dispositivo é capaz de perfusão automatizado de 16 soluções diferentes para uma câmara de cultura de células usando um esquema de válvulas multiplexados. O projeto do canal garante que a resistência de todas as entradas é equilibrado. Nosso projeto microválvula isola soluções e controles de lavagem por meio de canais integrada para a remoção rápida de líquido, o que limita a contaminação cruzada. Um misturador herringbone integrado pode ser ativado para produzir misturas de entradas diferentes. Além disso, existem quatro canais de resistência variável que pode ser ativado para alterar a taxa de fluxo.

<ol>
	<li>Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mixing+of+photolithographically-defined+nanoliter+volumes+using+elastomeric+microvalve+arrays.">Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays.</a> Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li></ol>

Principais vantagens de nosso projeto microválvula: <ol><li> Nenhuma fonte de energia extra é necessário para fechar o caminho fluídico, portanto, o dispositivo de carga é altamente portátil e </li><li> O dispositivo pode ser construído por réplicas de PDMS photolithographically com estampas SU-8 moldes, permitindo microfabricating profundas (até 1 mm) canais com paredes laterais verticais (ou seja, a altura de os recursos podem ser especificados independentemente de sua largura) e resultando em muito características precisas....

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Clean silicon wafers</td>
<td>Supplies</td>
<td>Silicon Sense Inc.</td>
<td>3P0110TEST</td>
<td>3-inch diameter, P/Boron</td>
</tr>
<tr>
<td>"Master" wafers containing SU-8 patterns</td>
<td>Supplies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fabricated in house using standard photolithography procedures </td>
</tr>
<tr>
<td>Desiccators (2)</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>24987-048</td>
<td>One for silanization, one for PDMS de-bubbling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Balance</td>
<td>Equipment</td>
<td>OHAUS Corp.</td>
<td>SC6010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sheldon Mfg. Inc.</td>
<td>1330GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MiniVortexer</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>58816-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinner</td>
<td>Equipment</td>
<td>Headway Research Inc.</td>
<td>PWM32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma etcher</td>
<td>Equipment</td>
<td>Plasmatic Systems Inc. </td>
<td>Plasma Preen II-973</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Plate</td>
<td>Equipment</td>
<td>Torre Pines Scientific</td>
<td>HP30A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>Equipment</td>
<td>Diagnostic Instruments</td>
<td>SPOT RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Solenoid valves</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lee Company</td>
<td>LHDA0511111H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Data acquisition board</td>
<td>Hardware</td>
<td>National Instruments</td>
<td>PCI 6025E, CB-50LP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LabView</td>
<td>Software</td>
<td>National Instruments</td>
<td>Version 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
<td>Reagent</td>
<td>United Chemical Technologies</td>
<td>T2492</td>
<td>Silanization must be done in a chemical fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS prepolymer and crosslinker</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow-Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hexane</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD	</td>
<td>HX0295-6	</td>
<td>

</td>
</tr>
<tr>
<td>Color Dyes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td>
<td>FD&C 110, 135, 150</td>
<td>Blue #1, Yellow #5, Red #3. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>3 ml disposable transfer pipets</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Weighing boats</td>
<td>Supplies</td>
<td>VWR </td>
<td>12577-027</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Tongue depressor</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Fisher Scientific	</td>
<td>11-700-555	</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P100 dishes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-772E</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.))</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.</td>
<td>07625-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in)</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.	</td>
<td>06418-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Duco Cement</td>
<td>Supplies</td>
<td>Devcon</td>
<td>6245</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>Tools</td>
<td>VWR</td>
<td>55411-050</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0053482 (25 Gauge)</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>#5 Forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-526B</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Seal wrap film</td>
<td>Supplies	</td>
<td>AEP Industries Inc.	</td>
<td>0153877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-406-16</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes	</td>
<td>Supplies	</td>
<td>BD Falcon	</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purple nitrile power-free gloves</td>
<td>Supplies 	</td>
<td>VWR 	</td>
<td>40101-348</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.2 mm Harris biopsy punch	</td>
<td>Tools</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>15074	</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays

Miniaturizados sistemas microfluídicos fornecer soluções simples e eficazes de baixo custo point-of-care diagnóstico e de alto rendimento ensaios biomédicos. Controle de fluxo robusto e preciso volumes fluídico dois requisitos, essenciais para essas aplicações. Nós desenvolvemos chips microfluídicos com elastomérico PDMS (polidimetilsiloxano) matrizes microválvula que: 1) não necessitam de fonte de energia extra para fechar o caminho fluídico, portanto, o dispositivo de carga é altamente portátil e 2) permitir microfabricating profundas (até 1 mm) canais com paredes laterais verticais e resultando em características muito precisas. O PDMS microválvulas dispositivos baseados composto por três camadas: uma camada fluídica contendo caminhos fluídico e microchambers de vários tamanhos, uma camada de controle contendo os microcanais necessário accionar o caminho fluídico com microválvulas, e um meio de membranas PDMS fino que é vinculado ao controle camada. Camada fluídica e camadas de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 mestres fotorresiste, ea membrana PDMS fino é feito girando PDMS em alturas especificadas. A camada de controle é ligada à membrana fina PDMS após a ativação de oxigênio de ambos, e, em seguida, montados com a camada fluídica. O microválvulas são fechados em repouso e pode ser aberto através da aplicação de pressão negativa (por exemplo, o vácuo casa). Microválvula fechamento e abertura são automatizados através de válvulas solenóides controlados por software de computador. Aqui, demonstramos dois microválvula baseado em chips microfluídicos para duas aplicações diferentes. O primeiro chip permite armazenar e mistura precisa sub-nanolitros volumes de soluções aquosas em vários índices de mistura. O segundo chip permite controlado por computador perfusão de culturas de células microfluídicos. Os dispositivos são fáceis de fabricar e simples de controlar. Devido à biocompatibilidade do PDMS, estes microchips poderia ter amplas aplicações na miniaturizados ensaios de diagnóstico, bem como estudos de biologia básica da célula.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Demonstramos protocolos para a fabricação e automação elastomérico polidimetilsiloxano (PDMS) com base em matrizes de microválvula que não precisam de energia extra para fechar e apresentam photolithographically definido volumes precisos. Um misturador subnanoliter volume paralelo e um sistema de perfusão integrado microfluídicos são apresentados.

Chips microfluídicos controlados com Arrays microválvula elastoméricos

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

microfluidic-chips-controlled-with-elastomeric-microvalve-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K visualizações.  University of Washington. Demonstramos protocolos para a fabricação e automação elastomérico polidimetilsiloxano (PDMS) com base em matrizes de microválvula que não precisam de energia extra para fechar e apresentam photolithographically definido volumes precisos. Um misturador subnanoliter volume paralelo e um sistema de perfusão integrado microfluídicos são apresentados.

Vídeo: Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biologia

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de célula usando um dispositivo micro

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

Fabricação dos canais microfluídicos Termoplásticos

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

Aplicações microfluídicos para diagnóstico descartáveis

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...