A marcação de células-tronco e sua descendência com uma linhagem transgênica indutível traçando linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação de células-tronco adultas no cérebro in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta às intervenções e a multi potência. As vantagens das abordagens de rastreamento de linhagem transgênica incluem especificidade de traçar uma determinada linhagem celular, expressão indelével da proteína fluorescente, independentemente da rotatividade celular ou diferenciação, baixa toxicidade da doxicyline, ativação condicional e facilidade de uso com ensaios comuns a jusante sobre tecidos de traço de linhagem, incluindo imunostaining e imunofluorescência.
Devido à ampla implicação da plasticidade e das células no cérebro adulto, a caracterização e análise das células-tronco adultas ajudarão a informar sobre o estudo de doenças neurodegenerativas, impactos metabólicos na plasticidade cerebral, envelhecimento e outras condições relacionadas. Para começar, deslizes quentes para temperatura ambiente e pós-fixação com acetona gelada por 15 minutos. Lave os slides por cinco minutos em 1X enxágue tampão, tremendo a 60 rotações por minuto a temperatura ambiente entre cada passo.
Permeabilize para ficar em pé de antígenos nucleares com 0,3%Triton X-100 por 10 minutos em temperatura ambiente. Permeabilize para ficar em pé de antígenos citoplasmados com 0,3%Tween-20 por 10 minutos em temperatura ambiente. Realize a recuperação de antígenos por slides de micro-ondas em 50 a 100 mililitros de 1x DAKO Antígeno Recuperação solução em baixo por 10 minutos, duas vezes.
Em seguida, enxágue com tampão por cinco minutos em temperatura ambiente. incubar lâminas em 0,3%Typogen Black em 70% etanol por 20 minutos em temperatura ambiente e depois lavar com tampão de enxágue. Desenhe barreira hidrofóbica ao redor do tecido.
Bloqueie por 20 minutos a 37 graus Celsius com reagente bloqueador. E incubar com anticorpo primário diluído em anticorpo diluído durante a noite a quatro graus Celsius. Lave os slides por 10 minutos em temperatura ambiente.
No dia seguinte, incubar seções em anticorpos secundários Alexa Fluor por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas duas vezes em tampão de lavagem por 10 minutos. Cubra seções cerebrais em 100 microlitres de um a 500 anticorpos anti-GFP conjugados ao AlexaFluor 488, e incubar durante a noite a quatro graus Celsius para impulsionar o Fluor4 endógeno, marcando as células rastreadas.
No dia seguinte, lave com tampão de enxágue duas vezes. E depois lave em água DI corrente por cinco minutos. Contra-mancha com 100 nanogramas por mililitro 4'6-diamidino-2-fenilôndole por cinco minutos.
Em seguida, lave na água DI corrente por cinco minutos. Adicione uma gota de meio de montagem fluorescente seguro em cima de cada seção de tecido e vedação com uma mancha de cobertura de 22 milímetros por 22 milímetros. A imagem é recomendada no dia da montagem para garantir o sinal ideal.
Para começar a fixação e secção após perfusão transcardial cérebros pós-fixação em 4% PFA durante a noite a quatro graus Celsius. E então novamente por uma hora em temperatura ambiente. Lave os cérebros em 1x PBS por uma hora duas vezes à temperatura ambiente.
Corte o cérebro em seções de um milímetro de espessura usando o bloco cerebral sagital e coloque em cinco tubos de micro centrífugas de cinco mililitros contendo 1x PBS. Para pré-tratamento de metanol, comece lavando com 1x PBS por uma hora duas vezes à temperatura ambiente. Lave em 50% de metanol por uma hora em temperatura ambiente.
Lave em 80% de metanol por uma hora em temperatura ambiente. Lave em 100% de metanol por uma hora, duas vezes, à temperatura ambiente. Amostras de alvejante com peróxido de hidrogênio de 5% em 20% de sulfóxido de dimetila e metanol a quatro graus Celsius durante a noite.
Após branqueamento, lave amostras de metanol por uma hora duas vezes à temperatura ambiente. Lave em 20% de sulfóxido de dimetil e metanol por uma hora duas vezes à temperatura ambiente. Lave em 80% de metanol por uma hora em temperatura ambiente.
Lave em 50% de metanol por uma hora em temperatura ambiente. Lave em PBS por uma hora duas vezes à temperatura ambiente. Lave em PBS 0,2%Triton X-100 por uma hora duas vezes à temperatura ambiente.
Para imunostain de cérebros de limpeza, comece incubando amostras em 1x PBS, 0,2%Triton X-100, 20%DMSO, 0,3 molar glycine, a 37 graus Celsius durante a noite em um agitador orbital. Bloco em 1x PBS, 0,2%Triton X-100, 10% DMSO, 6% soro de cabra a 37 graus Celsius por três dias em um shaker orbital. Lave amostras em 1x PBS, 0,2%Tween-20, 10 microgramas por mililitros de sal de sódio heparina da mucosa suína por uma hora duas vezes a 37 graus Celsius.
Em seguida, incubar em 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgramas por mililitros heparina, 5%DMSO, 3% soro de cabra contendo uma a 500 concentrações de coelho anti GFP AlexaFluor 488 a 37 graus Celsius em um shaker orbital por dois dias. Lave amostras em 1x PBS, 0,2% Tween-20 com 10 microgramas por mililitro heparina por uma hora a 37 graus Celsius em um shaker orbital três vezes e depois uma vez por dia durante dois dias. Incubar amostras durante a noite em um mililitro de 50% tetrahidrofurano e água.
Incubar amostras por uma hora em um mililitro de 80% THF Tetrahidrofuran e água. Incubar amostras duas vezes por uma hora em 100% Tetrahidrofuran. Seque amostras com um lenço estéril e incubar em diclorometano até afundarem no fundo do frasco.
Não incubar por mais de 60 minutos. Incubar amostras em um mililitro de éter dibenzyl até ficar claro. Armazene amostras em éter dibenzyl à temperatura ambiente até estar pronto para a imagem.
Para imagem de seções cerebrais imunossutives, analise slides via microscopia confocal, onde a co-expressão de múltiplos anticorpos pode ser confirmada. Usamos um microscópio Leica Stellaris cinco com detectores híbridos HyD S. Para cérebros limpos de imagem, use um microscópio confocal invertido com um estágio automatizado e função de revestimento automatizado.
Comece colocando uma seção cerebral limpa plana contra um prato de fundo de vidro em submergir em éter dibenzyl. Uma diferença notável na intensidade fluorescente em diferentes regiões cerebrais e vários tipos de células foi observada após um período de perseguição de pulso na linhagem traçada cérebros. As células epiteliais choroides no plexo coroóide tinham uma membrana celular espessa e forte sinal fluorescente verde indicando que derivavam de células positivas tert que era facilmente distinguível das células circundantes.
Os outros tipos de células menores no plexo choroide tinham um sinal GFP mais fraco. No cerebelo, as células gliais bergmann expressavam níveis mais elevados de GFP do que células cestas, e a variação na expressão GFP também existia entre células de cesta individuais. Para os axônios sensoriais de fábrica dentro da camada glomerular da lâmpada olfativa também expressaram altos níveis de axônios sensoriais GFP que preenchem a camada glomerular da lâmpada olfativa expressando altos níveis de tomate membrana, ou fluorescência vermelha quando comparados com a maioria das outras regiões cerebrais, mesmo quando os mesmos neurônios são GFP positivo indicando que algumas células pareciam perder mTomato sinal mais lentamente durante o rastreamento.
Em contraste, nas células positivas plexus plexus coroides expressas baixo mTomato. Na maioria das outras regiões cerebrais, os sinais de tomate expressos em baixo nível na maioria dos tipos de células com células endoteliais são algumas das únicas células cujo sinal fluorescente era brilhante o suficiente para se destacar distintamente do fundo fluorescente vermelho do tecido cerebral. A coisa mais importante a se lembrar é que o sinal fluorescente em cérebros limpos desaparece mais rápido do que a maioria dos outros ensaios imunológicos.
Lembre-se de imaginar suas amostras o mais rápido possível e dentro de sete dias. A seguir, imagens de fatias cerebrais ou cérebros claros, coloração de marcadores com os sinais GFP e nossa quantificação de Fluorence podem ser realizadas usando programas de software.
