Somos gratos a S. Arber para os ratos mGFP e aos membros do laboratório que Zervas criticamente ler o jornal e prestou assistência técnica. A. Brown foi apoiado por uma Kaplan Ciência Prêmio Cérebro Verão de Pesquisa de Pós-Graduação. E. Normand foi apoiado por uma Ciência Prêmio Programa de Pós-Graduação Brain Research. Esta pesquisa também foi financiada por fundos de pesquisa de inicialização (MZ).

Tamoxifeno Preparação e Procedimento Gavage Oral (E8.5) <ul><li> Prepare uma solução estoque 20 mg / ml de tamoxifeno dissolvendo tamoxifeno na pré-aquecido o óleo de milho. </li><li> Incubar a solução a 37 ° C por 2 horas em um vortex nutator e de forma intermitente. </li><li> Proteger o estoque da loja tamoxifeno luz, a 4 ° C, e usar por até um mês. </li><li> Para experimentos de mapeamento destino, estabelecer um par de reprodução que consiste em um Webster suíço feminino (tipo selvagem; comprado de Taconic) e um macho portador tanto um gene específico creer alelo T e um alelo repórter. Para fins de demonstração, estamos usando Wnt1 creer-T; mGFP homens (Ellisor 2009). </li><li> Verifique fêmeas suíço Webster todas as manhãs para o aparecimento de um plug vaginal. Designar pela manhã (0900) do dia um plug vaginal é visto como 0,5 dias pós-coito e calcular a data de administração do tamoxifeno com base neste ponto de partida. (Para este experimento, dia embrionário 8.5 foi utilizado). </li><li> Use uma seringa de 1 ml com agulha de alimentação animal (20G x 1-1/2) a elaboração de 200 mL da solução de tamoxifeno (4 mg tamoxifeno). </li><li> Firmemente restringir o tempo de gravidez suíço feminino Webster segurando a nuca do pescoço e costas para imobilizar a cabeça e virar para o lado ventral é voltada para cima. </li><li> Segure a cauda entre os dedos livres para manter o corpo em uma linha reta. </li><li> Coloque a agulha de alimentação para o canto da boca e gentilmente guiar a agulha ao longo do céu da boca. </li><li> Gire a agulha para que ela fique paralela ao corpo, ao mesmo tempo, inclinando a cabeça para trás para manter o pescoço reto. </li><li> Guiar a agulha para o esôfago, em direção ao estômago. Tenha cuidado para não entrar na traquéia. Se houver resistência na agulha, envolve o animal reflexo de vômito, ou se o mouse lutas, remover imediatamente a agulha e tentar o gavage novamente. </li><li> Uma vez que a agulha é a alimentação no estômago, administrar o tamoxifeno para o estômago e voltar a fêmea para a gaiola em casa até a data de dissecção. </li></ul> Craniotomia: <ul><li> Intracardially perfundir o destino adulto mapeados mouse com PFA 4% e remover a cabeça com uma tesoura, cortando a coluna vertebral um pouco acima dos ombros. </li><li> Executar um bisturi ao longo da linha média dorsal da cabeça (rostral caudal) para cortar o couro cabeludo e expor o scull. </li><li> Usando o bisturi, raspar qualquer excesso de tecido ou músculo de ao longo da lateral e posterior do crânio. </li><li> Punção com uma pinça, o crânio na linha média rostral apenas para os bulbos olfatórios e criar um buraco pequeno para acomodar as pontas de uma tesoura fina. </li><li> Inserir a tesoura bem neste buraco e fazer uma incisão medial para lateral, aproximadamente o comprimento do bulbo olfatório. Este corte vai quebrar o crânio na intersecção do osso nasal e do osso frontal e fornecer acesso bom para a tesoura. </li><li> Corte ao longo das suturas sagital no crânio (linha média dorsal) certificando-se de manter as pontas em ângulo tesoura longe do cérebro para evitar danos ao tecido subjacente. </li><li> Gentilmente segure o crânio com uma pinça e descascar o osso ao longo da incisão medial para expor o cérebro. O crânio pode chip de fora em pequenos pedaços ou romper em seções maiores. Continuar a usar a pinça para retirar todos os ossos frontal, parietal, interparietal e occipital. </li><li> Rachar os ossos que envolvem os paraflocculi (localizado ao longo das bordas laterais do cérebro ao nível do cerebelo) apertando os ossos esférica de cada lado. Gentilmente se afastar dos ossos. </li><li> Gire a cabeça para baixo (lado dorsal para baixo) e use a pinça para cortar os nervos cranianos e libertar o cérebro do crânio. </li></ul> Microscopia Monte todo: Cérebro Adulto <ul><li> Avaliar cérebro adulto para GFP marcação utilizando um escopo fluorescentes de dissecação. </li><li> Transferência do cérebro para uma placa de Petri contendo PBS e fotografar usando PictureFrame ou software apropriado. </li></ul> Microscopia Monte todo: E12.5 Embriões <ul><li> Avaliar embriões montar toda a GFP marcação utilizando um escopo fluorescentes de dissecação. </li><li> Transferência aqueles que são GFP positivas por montar toda a uma placa de Petri contendo PBS e fotografar usando PictureFrame ou software apropriado. </li><li> Use uma pinça para beliscar fora um pequeno pedaço da cauda de cada embrião, coloque cada pedaço em um tubo de PCR e do genótipo do tecido usando PCR (Ellisor 2009) para ambos os alelos para confirmar os resultados vistos através de análise de montar todo. </li></ul> Micro dissecação e preparação do explante do mesencéfalo ventral de embriões E12.5 <ul><li> Após dissecção da cadeia uterina e identificação do destino mapeada embriões por todo o monte de fluorescência, embriões transferir para gelada estéril PBS em um prato de cultura de células. </li><li> Com uma tesoura fina, retire a parte da cabeça do embrião corte transversalmente, caudal de rhombomere 1. </li><li> Em seguida, remova a parte rostral da cabeça com um corte coronal através do diencéfalo. Isto irá expor uma estrutura de tubo, em que o ventrículo quarto através do formulário de vesícula mesencefálica um canal entre os tecidos dorsal e ventral. </li><li> Insira cuidadosamente a tesoura dicas para o ventrículo 4, e snip ao longo da linha média dorsal, caudal a rostral, totalmente a abertura do tubo, criando um &quot;livro aberto&quot; de preparação. Mesencéfalo ventral agora será exposta medialmente, enquanto as duas metades dorsal do mesencéfalo residirá lateralmente. </li><li> Remover qualquer tecido não-neural restantes debaixo do mesencéfalo ventral para que o tecido para colocar mais sem rodeios. Se necessário, fazer entalhes nos aspectos rostral e caudal de tal forma que o dorsal &quot;asas&quot; do explante vai colocar o plano também. O explante deve agora se parecer com uma borboleta &quot;, em que o mesencéfalo dorsal representa as asas, e rhombomere uma cauda. </li><li> Para isolar ainda mais o mesencéfalo ventral para FACS análise ou experimentos de cultura celular, remova a lateral (aspectos dorsal) do tecido. </li></ul> Resultados representativos: Neste experimento GIFM, Wnt1 células que expressam são permanentemente e hereditariamente marcado durante a embriogênese através da administração de tamoxifeno em E8.5 para Wnt1-CreERT; embriões mGFP. Posteriormente, essas células marcadas são visualizadas por meio de fluorescência montar todo e imunohistoquímica seção para determinar como Wnt1 células derivadas de contribuir para estruturas neurais em desenvolvimento. Toda montagem de fluorescência depende o componente de membrana ligado GFP do repórter mGFP e, portanto, fornece informações celular, bem como uma visão global de derivados de projeções Wnt1 neural. Por exemplo, com o tamoxifeno administração em E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embriões em E12.5 fluorescência da GFP mostra principalmente no mesencéfalo, rombencéfalo posterior ea medula espinhal (Figura 1A). Em grandes ampliações, multa projeções neuronais são vistos inervação do mesencéfalo, parede do corpo, a integridade física, e na região craniofacial. Nesta fase de desenvolvimento, o embrião é translúcido e rotulagem GFP interna é facilmente percebida. No entanto, como o cérebro se desenvolve, a densidade do tecido maduro obscurece GFP fluorescência proveniente de estruturas cerebrais internas. Portanto, com tamoxifeno administração em E8.5, apenas rotulagem GFP menor é observado no colículos superiores do adulto por toda montagem de fluorescência (Figura 1C, detalhe). Além disso, algumas projeções axonais são vistos correndo ao longo da superfície ventral do cérebro posterior (não mostrado). Em contraste, quando o tamoxifeno é administrado em E9.5, rotulagem GFP substancial ocorre em todo o colículo inferior inteira (Figura 1B, inset). Este aumento na fluorescência montar toda pode indicar que Wnt1 células que expressam em E9.5 contribuir mais significativamente para a regiões superficiais do mesencéfalo dorsal ou estender os processos mais dentro desta região de células que expressam Wnt1 de E8.5. Independentemente disso, esta diferença no todo montagem de fluorescência reflete a natureza dinâmica do Wnt1 expressão durante o desenvolvimento e demonstra como GIFM pode ser usado para seguir populações de células distintas do embrião para o adulto maduro. Com imunohistoquímica, o destino de secções de tecido mapeados a partir Wnt1-CreERT; animais mGFP são analisadas no nível celular. Anticorpos contra GFP e β-galactosidase (β-gal) são usados ​​em conjunto com uma variedade de tecidos específicos biomarcadores para determinar a contribuição escala fina celulares da linhagem Wnt1 às estruturas neurais e tipos celulares. Com tamoxifeno administração em E8.5 e análise de tecidos em E12.5, duplo células positivas (GFP + e + β-gal) são observados ao longo do mesencéfalo e rombencéfalo com projeções correndo através do mesencéfalo ventral (Figura 1B). No cérebro adulto, o Wnt1 linhagem marcados a E8.5 dá origem a estruturas mesencéfalo, inclusive a colículos superiores e inferiores, bem como nas proximidades de populações de células dopaminérgicas da área tegmental ventral e substantia nigra (Figura 1D) (ver também Zervas 2004). Em contraste, a linhagem Wnt1 marcados a E9.5 dá origem ao colículo inferior, bem como para os neurônios nos arredores de populações de células dopaminérgicas (Figura 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Resultados Representante para Wnt1 destino mapeamento.: Exemplos de toda montagem e resultados imunocitoquímica em Wnt1-CreERT; embriões mGFP e destino cérebros adultos mapeados (marcado) em E8.5 (AD)e E9.5 (EF). A. Wnt 1-creer; embriões mGFP na E12.5 fluorescência da GFP mostra principalmente no mesencéfalo (Mb), rombencéfalo posterior (Hb) ea medula espinhal (Sp). Células B. Marcado visualizados e analisados ​​a nível celular por imuno-histoquímica como mostrados nesta seção um mícrons de espessura óptica (objetiva de 40x, z-series aquisição). Rotulagem de anticorpos nucleares β-galactosidase (nβ-gal) (vermelho) e GFP rotulagem de anticorpos (verde) indica o destino mapeada células mostrado no mesencéfalo ventral. Aqui, as células recombinadas são duplamente positivo (nβ-gal + / GFP +) por causa da natureza do repórter mGFP condicional. C. Todo-mount microscopia de fluorescência revela fluorescência da GFP fraco no colículo superior (SC) do adulto (inset). Avaliar a linhagem Wnt1 marcado em E8.5 em seções adultos com baixa ampliação (5x) A microscopia revela que a linhagem Wnt1 dá origem a estruturas mesencéfalo, incluindo o superior (SC) e inferior (IC) colículos (C). D. A 40x, seção 1 mm óptica retirado do mesencéfalo ventral na vizinhança dos neurônios dopaminérgicos com células-gal nβ + e uma rica GFP + plexo axonal. E. Marcação de resultados E9.5 na rotulagem GFP substancial que é facilmente observado no colículo inferior do mesencéfalo por toda montagem de fluorescência (inset). A linhagem Wnt1 marcado em E9.5 em seções para adultos (+ β-gal, vermelho) está concentrada no colículo inferior (mesencéfalo dorsal-posterior), como visto com baixa ampliação (5x) microscopia (E). F. A 40x, seção 1 mm óptica retirado do mesencéfalo ventral na vizinhança dos neurônios dopaminérgicos com células-gal nβ + e uma rica GFP + plexo axonal. Neurônios Wnt1 derivados marcado em E8.5 E9.5 contra são progressivamente restrito de contribuir para mesencéfalo dorsal, enquanto a linhagem Wnt1 persiste em contribuir para mesencéfalo ventral.

<ol>
	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

Todos os autores contribuíram igualmente para este trabalho e estão listados em ordem alfabética. A contribuição de cada indivíduo é aparente por sua participação no artigo vídeo.

O sistema GIFM que temos demonstrado pode ser usado para responder a uma ampla gama de questões em uma variedade de processos celulares. Por exemplo, ratos geneticamente modificados com drivers diferentes Cre pode ser usado para atingir qualquer tipo de célula, tecido ou linhagem genética de interesse. Além disso, como o tamoxifeno pode ser administrado em nenhum momento embrionário ou pós-natal, a recombinação pode ser direcionada para qualquer fase de desenvolvimento relevantes. O controle espacial e temporal ...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

Mapas destino são gerados por marcação e rastreamento de células in vivo para determinar como progenitores contribuir para estruturas específicas e tipos de células no desenvolvimento e tecidos adultos. Um avanço neste conceito é G enetic eu nducible F comeu Mapear (GIFM), ligando a expressão do gene, o destino de células, e os comportamentos de células in vivo, para criar mapas de destino com base na linhagem genética. GIFM exploits X-creer linhas onde X é um gene ou conjunto de elementos reguladores de genes que conferem expressão espacial de uma proteína bacteriófago modificados, Cre recombinase (creer T). Creer T contém uma versão modificada e estrogênio r domínio ligante eceptor ligação que torna creer T seqüestrado no citoplasma na ausência da droga tamoxifen. A ligação do tamoxifeno releases creer T, que transloca para o núcleo e recombinação faz a mediação entre seqüências de DNA flanqueado por sites loxP. Em GIFM, a recombinação ocorre normalmente entre um loxP ladeado Parar cassete precedentes um gene repórter, como GFP. Camundongos são criados para conter uma região ou célula creer tipo específico e um alelo repórter condicional. Ratos não tratados não terá marcação porque a cassete Parar na transcrição impede repórter adicional do gene repórter. Nós administrar tamoxifeno por sonda oral para grávidas timed-fêmeas, que oferece um controle temporal da liberação creer T e translocação subseqüente ao núcleo remover a cassete Parar a partir do repórter. Após a recombinação, o alelo repórter é constitutivamente expressa e hereditariamente. Esta série de eventos marca as células de tal forma que sua história genética está indelevelmente gravada. O repórter recombinados, portanto, serve como um marcador de alta linhagem genética que a fidelidade, uma vez, é desacoplado da expressão do gene inicialmente usado para acionar T creer. Nós aplicamos GIFM em rato para estudar o desenvolvimento normal e contribuição de tomar conhecimento das linhagens genéticas de tipos de células adultas e tecidos. Nós também usamos GIFM para seguir em células mutantes origens genéticas para compreender melhor fenótipos complexos que imitam características mais salientes das doenças genéticas humanas. Este artigo vídeo guias pesquisadores através de métodos experimentais para aplicar com êxito GIFM. Nós demonstramos o método usando o nosso bem caracterizada Wnt1-creer T; ratos mGFP pela administração do tamoxifeno no dia embrionário (E) 8.5 via gavagem oral, seguida de dissecção no E12.5 e análise por estereomicroscopia epifluorescência. Também demonstramos como micro-destino dissecar domínios mapeados para a preparação do explante ou análise FACS e dissecar adultos destino cérebros mapeados para a imagem latente montar toda fluorescente. Coletivamente, esses procedimentos permitem aos pesquisadores para debater questões críticas em biologia do desenvolvimento e modelos de doença.

Watch this Scientific Journal Video about A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo at JoVE.com

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal bem<em&gt; In vivo</em&gt; E elucida como as células de uma linhagem genética específica contribuir para o desenvolvimento e tecidos adultos. Demonstrado aqui são as técnicas necessárias para o destino mapa E12.5 embriões de camundongos para a análise de epifluorescência e explante.

Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K visualizações.  Brown University. Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal bem In vivo E elucida como as células de uma linhagem genética específica contribuir para o desenvolvimento e tecidos adultos. Demonstrado aqui são as técnicas necessárias para o destino mapa E12.5 embriões de camundongos para a análise de epifluorescência e explante.

Vídeo: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Um sistema de acoplamento magnético para Investigar controle de vôo visual e olfativo Mediated em Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Um Guia Prático para Phylogenetics para não especialistas

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...