Este protocolo mostra a criação de uma grande janela craniana para medir atividades de reserva de campo amplo e de célula única no mesmo mouse. Usando o nosso método, a janela craniana grande e estável pode ser feita com embalagem de alimentos a baixo custo. Este método é eficaz para estudar as atividades neurais e gliais durante o comportamento em níveis macroscópicos e microscópicos.
Recomenda-se começar com uma pequena janela craniana. Então, se for bem-sucedido, aumente o tamanho da janela. Comece removendo o cimento extra sobre o crânio com uma broca dentária.
Marque a área a ser cortada com uma caneta. Corte o osso usando um bisturi com uma ponta contundente para garantir que a ponta não penetre no crânio. Raspe o osso repetidamente com um bisturi para aprofundar o sulco até que o osso na área a ser aparada se mova quando levemente tocado.
Remova o osso incisado com uma pinça fina. Seja cauteloso para não empurrar o retalho ósseo para o cérebro, o que pode danificar o cérebro. Para remover a dura-máter, corte a dura-máter usando uma pipeta de vidro puxada com uma ponta cônica de cerca de 10 micrômetros.
Use uma agulha em forma de U para expandir esse corte por toda a janela. Sob um microscópio estéreo ajustado em zoom de 60 a 100x, remova a dura-máter cortada com uma pinça ultrafina. Em caso de sangramento, enxaguar com um LCR ou usar uma esponja de gelatina para parar o sangramento.
Em seguida, esterilize um grande pedaço de envoltório de PVDC por autoclave e com etanol a 70%. Sob um microscópio estéreo, use uma pinça e um bisturi para cortar um envoltório do tamanho necessário. Coloque o envoltório na superfície do cérebro, deixando o aCSF na superfície.
Sugue o aCSF da borda do envoltório, permitindo que o envoltório grude firmemente na superfície do cérebro. Apare o envoltório com um bisturi e uma pinça de modo a que haja aproximadamente uma margem de um milímetro entre a borda da janela craniana e o envoltório. Uma vez que o envoltório esteja no lugar, cole a borda do envoltório ao crânio com um adesivo biológico.
Deixe o adesivo secar por cerca de 30 minutos. Usando um dispensador com uma ponta de mistura, aplique um elastômero de silicone transparente em cima do envoltório. Coloque o vidro de cobertura de espessura de 0,12 a 0,17 milímetros por cima.
Sele o perímetro do vidro de cobertura com filme impermeável, supercola ou cimento dental. Primeiro, misture as soluções de fibroína e AAV em uma proporção de um a quatro em um pequeno tubo de amostra. Solte uma alíquota da solução no filme plástico para a janela craniana e seque-a por pelo menos três horas.
Em seguida, anexe o envoltório à superfície do cérebro, como mostrado na seção anterior. Verifique a condição dos ratos e janelas regularmente, duas a quatro semanas. Por esta altura, os indicadores de cálcio geneticamente codificados serão expressos suficientemente após a criação da janela tratada com AAV.
Usando este protocolo, as janelas cranianas poderiam ser mantidas em oito de 10 camundongos por até 10 semanas. Uma ampla janela é criada com filme plástico, silicone transparente e vidro de cobertura em um rato transgênico que expressa indicador de cálcio geneticamente codificado ancorado por membrana em astrócitos. Imagens de cálcio de campo amplo foram realizadas através desta janela e alterações de fluorescência foram observadas quando a estimulação do sopro de ar foi aplicada aos bigodes contralaterais.
O curso temporal da mudança de fluorescência no córtex somatossensorial mostrou atividade cortical. A imagem de dois fótons permitiu a observação de imagens de fluorescência de célula única específicas para células gliais. Alterações de fluorescência induzidas por estimulação sensorial foram observadas em células individuais de diferentes regiões corticais.
Envoltório codificado com AAV expressando indicador de cálcio geneticamente codificado; e fibroína foi usado para fazer a janela craniana. Imagens de cálcio de campo amplo mostraram atividade cortical se propagando pelo córtex induzida por estimulação sensorial duas a quatro semanas após a cirurgia. Como a janela era grande, diferentes áreas corticais do mesmo camundongo foram fotografadas e alterações de fluorescência induzidas pela estimulação sensorial foram observadas em células individuais.
É importante evitar danos ao cérebro ao fazer janela craniana. Pode-se executar tarefas de comportamento em ratos com uma grande janela craniana. Isso permitirá examinar a relação entre a atividade neural e o comportamento do rato.
Este método pode ser aplicado a uma variedade de estudos de neurociência. Por exemplo, ele pode ser usado para observar a atividade cortical durante tarefas de tomada de decisão, corrida motora e em modelos de massa de lesão cerebral e doença.
