Esse protocolo é significativo porque permite aos pesquisadores amadurecer os hiPSC-CMs comerciais ou internos para um fenótipo semelhante ao adulto que melhora significativamente o valor preditivo dos hiPSC-CMs no rastreamento de cardiotoxicidade. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece hiPSC-CMs maduros em um formato de alto rendimento para mapeamento óptico de cálcio ou mudança de tensão. Esse protocolo pode ser usado para investigar mecanismos de doença ou para rastrear drogas para cardiotoxicidade.
Quem demonstrará o procedimento será Jeffrey Creech, pesquisador associado do meu laboratório. Comece lavando as placas da matriz extracelular indutora de maturação, ou MECM, duas vezes com 200 microlitros de solução salina balanceada de Hank, ou HBSS, 1 hora antes do plaqueamento dos cardiomiócitos. Mantenha os poços hidratados.
Transfira os tubos de cardiomiócitos do tanque de nitrogênio líquido para o gelo seco e libere a pressão abrindo ligeiramente as tampas do tubo. Em seguida, feche novamente as tampas dos tubos e descongele-as em banho-maria por 4 minutos. Após o descongelamento das células, borrife os tubos com etanol 70% antes de abri-los.
Transfira as células para tubos cônicos de 15 mililitros com uma pipeta de 1 mililitro. Adicione 1 mililitro de meio de chapeamento ao criovial e transfira a lavagem para o tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, goteje lentamente 1 mililitro de meio de chapeamento e agite o tubo.
Repita até a transferência de 8 mililitros de meio de chapeamento. Centrifugar o tubo de 15 mililitros a 300 x g por 5 minutos e ressuspender o pellet em 1 mililitro do meio de chapeamento. Remova uma alíquota e realize a contagem de células vivas com um hemocitômetro antes de adicionar um meio de plaqueamento para obter 7,5 x 10 a 5ª células por mililitro.
Dispensar 100 microlitros da suspensão celular por poço de uma placa de 96 poços revestida com MECM usando uma pipeta multicanal e incubar as células por 2 dias. Em seguida, substitua o meio por 200 microlitros de meio de manutenção, e mantenha as placas por 7 dias, com troca de meio no dia 5. No 7º dia, realizar ensaio de EP, conforme descrito no texto.
Certifique-se de trocar o meio a cada dois dias ao optar por estender a cultura celular. Para purificar o hiPSC-CM via triagem celular ativada por magnetismo, ou MACS, aspirar o meio de cultura celular e lavar as células com 1 mililitro de HBSS-Em seguida, dissociar as células adicionando 1 mililitro de 0,25% de tripsina-etilenodiaminotetracético, ou EDTA, e incubar as células por 10 minutos. Em seguida, inative a tripsina/EDTA reenviando e singularizando as células com 2 mililitros de meio de plaqueamento.
Dos seis poços, colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros usando um filtro de 70 micrômetros. Depois de lavar o filtro com 3 mililitros de meio de chapeamento, conte as células. Após a contagem, centrifugar e lavar o pellet celular com 2 mililitros de tampão de separação MACS gelado antes de peletizar e reenviar as células em 80 microlitros de tampão de separação MACS frio por 5 x 10 para a 6ª célula.
Adicione 20 microlitros de coquetel frio de depleção de cardiomiócitos e misture a suspensão antes de incubar no gelo por 10 minutos. Após lavar as células com 4 mililitros de tampão de separação MACS frio a 300 x g por 5 minutos, ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão de separação MACS frio. Adicione 20 microlitros de microesferas frias anti-biotina por 5 x 10 às 6ª células e misture suavemente a suspensão celular antes de incubar no gelo por 10 minutos.
Enquanto as amostras estiverem incubando, coloque as colunas de depleção positiva equipadas com os filtros de pré-separação de 30 micrômetros no separador MACS e coloque os tubos de coleta de 15 mililitros rotulados abaixo das colunas. Em seguida, prima cada coluna com 3 mililitros de buffer de separação MACS frio. Misture a suspensão celular tratada com anticorpos com 2 mililitros de tampão de separação MACS e adicione-a à coluna.
Adicione 2 mililitros de tampão de separação MACS a cada coluna e colete 12 mililitros de suspensão de cardiomiócitos flowthrough. Centrifugar os cardiomiócitos e descartar o sobrenadante antes de ressuspender os cardiomiócitos em meio plaqueado de 1 mililitro. Para determinar a concentração, conte as células e ajuste o volume para a densidade de semeadura desejada antes de plaquear as células purificadas de cardiomiócitos nas placas de 96 poços do MECM.
Aspirar e substituir o meio de manutenção do cardiomiócito por 100 microlitros de corantes sensíveis à voltagem, ou CIV, ou fluoróforos sensíveis ao cálcio, ou LCR, por poço de uma placa de 96 poços. Após 30 minutos de incubação, substituir os corantes por meio de ensaio ou HBSS. Equilibre as células a 37 graus Celsius antes de adquirir o mapeamento óptico de dados de linha de base usando um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento.
Para tratar as células com drogas para teste de exposição aguda ou mapear as células cronicamente expostas a drogas de interesse, diluir as drogas em dimetil sulfóxido, ou DMSO, e armazená-las como soluções estoque a 20 graus Celsius antes de diluí-las em HBSS para as concentrações desejadas. Para testes de cardiotoxicidade em placas de 96 poços, adicione quatro doses de um composto com pelo menos oito poços por dose. Use doses que variam de abaixo a acima da concentração plasmática terapêutica clinicamente eficaz, incluindo a dose efetiva.
Semelhante às medidas eletrofisiológicas basais antes da aplicação da droga, os registros de eletrofisiologia de captura pelo menos 30 minutos após o tratamento medicamentoso para estudos crônicos. Após os registros basais, aplicar pelo menos quatro doses de cada medicamento em monocamadas maduras de hiPSC-CMs expressando GCaMP6m, com pelo menos oito poços por dose. Equilibre os medicamentos nas células por 30 minutos e aqueça as células a 37 graus Celsius antes e durante a aquisição de dados.
Após os registros basais de uma placa inteira, adicione 500 isoproterenol nanomolar a cada poço para permitir dados robustos de resposta a drogas e quantificar os efeitos do isoproterenol na taxa de batimento da monocamada, amplitude de contração e duração transitória de cálcio. Para adquirir dados de mapeamento óptico, abra a gaveta frontal e posicione a placa no aquecedor de placas. Depois de abrir o software de aquisição e determinar o local de salvamento do arquivo no software, selecione a duração de 10 a 30 segundos e a taxa de quadros de aquisição para maior resolução temporal e clique em Iniciar aquisição.
Abra o software de análise e, na guia Filtro de Importação, selecione Procurar um único arquivo ou Múltiplos de blocos para reconstruir uma placa. Selecione os arquivos e insira um número de linhas e colunas e selecione Automático. Em seguida, selecione Atualizar Tamanho do Pixel, insira a distância por pixel e use o Assistente de Poço para determinar a localização dos poços na imagem antes de clicar em Processar Salvar e passar para a próxima guia.
Abra a aba ROIs, ou Regiões de Interesse, e opte por desenhar as ROIs manualmente, automaticamente ou não use ROIs, que serão consideradas para a análise de toda a placa. Depois de selecionar a região no poço, clique no botão Processar salvar para passar para a próxima etapa. Marque as caixas Ocultar poços e Mostrar somente filtrado para visualizar as ROIs.
Abra a guia Análise, selecione cada poço ou ROI para confirmar a precisão da detecção automática de batidas. Adicione ou remova batidas dos rastreamentos selecionando uma batida individual e pressionando Delete no teclado. Uma vez feito, clique em Salvar.
Em seguida, clique no botão Gráfico de Espaço-Tempo na guia Análise e adicione a linha para determinar o gráfico de espaço de tempo para visualizar os dados de cada poço ou do ROI. Depois de selecionar uma linha horizontal ou vertical, clique em Gerar Gráfico. Depois de garantir a detecção precisa de batidas, vá para a guia Exportar e selecione Formato de arquivo, insira a opção Estatística de batida antes de clicar em Exportar.
Uma vez exportados, abra os arquivos de dados e execute a rotina de análise estatística escolhida. A imagem de contraste de fase mostrou que os hiPSC-CMs plaqueados no MECM amadureceram e se tornaram estruturalmente distintos do mesmo lote de hiPSC-CMs replaqueados no ECM de camundongos. As células maduras tornaram-se em forma de bastonete, enquanto as células imaturas mantiveram uma forma circular.
Os cardiomiócitos corados com anticorpos alfa-actinina mostraram a forma típica das células cultivadas em cada condição da MEC. Consistente com a coloração TnI, a coloração alfa-actinina indicou que os MC-hiPSC amadurecidos na MECM promoveram um fenótipo maduro em forma de bastonete e induziram maior organização dos sarcômeros. O conteúdo e a atividade mitocondrial foram distintos entre as células cultivadas na MEC e na MECM de camundongos.
Os dados eletrofisiológicos dos potenciais de ação registrados por meio de CIVs e do sistema de mapeamento óptico mostraram que as células atriais específicas têm uma taxa de batimento espontâneo significativamente mais rápida e menor duração do potencial de ação, ou APD80, do que as células ventricular-específicas. Mapas de calor de placas inteiras para parâmetros como APD80 revelaram a reprodutibilidade de um determinado parâmetro dentro de uma placa. Potenciais de ação típicos de monocamadas hiPSC-CM maduras indicaram a morfologia do potencial de ação de cardiomiócitos adultos isolados e testados.
Um ritmo espontâneo típico de potencial de ação também foi exibido. Em resposta ao isoproterenol, a ativação dos receptores beta-1-adrenérgicos causou cronotropia positiva, inotropia positiva e lusitropia positiva. A resposta da HiPSC-CM ao gene humano relacionado ao Ether-a-go-go, ou bloqueador de canal hERG, incluindo E-4031, domperidona, vandetanibe e sotalol, foi estudada usando fluorescência de cálcio GCaMP6m para monitorar o ritmo.
O estudo mostrou a detecção de pós-despolarizações precoces causadas pelo bloqueio do canal HERG E-4031. Trabalhe rapidamente com as células em suspensão e evite tensões de cisalhamento pipetando as células suavemente. Além disso, execute a troca de mídia cuidadosamente para evitar danificar a sincistica hiPS.
Após esse procedimento, as células são passíveis de coleta de proteínas, RNA, DNA e lipídios para análise com a técnica favorita dos investigadores. A técnica capacita os pesquisadores a investigar doenças e testar a cardiotoxicidade de novas drogas usando cardiomiócitos semelhantes aos adultos.
