Este protocolo é para cortar e culcular seções de tecido cardíaco por seis dias sob condições fisiológicas que podem ser usadas para testes agudos de toxicidade cardíaca, bem como testar a eficácia de terapias de insuficiência cardíaca. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo de humanos in situ para testes agudos de toxicidade cardíaca que fecha a lacuna entre os resultados pré-clínicos e clínicos de testes. Demonstrando os procedimentos estará Qinghui Qu, um gerente de laboratório do nosso laboratório.
Para obter fatias de tecido do coração de porco, primeiro adicione gelo à jaqueta de resfriamento do banho de tecido de um vibratome e adicione a solução de Tyrode ao banho. Use um frasco de plástico de um litro para coletar o escoamento de gelo derretido da jaqueta de resfriamento do banho de tecido e transfira o coração de porco para uma bandeja contendo um litro de solução cardioplégica fria fresca em um armário de biossegurança. Use bisturis estéreis retráteis para dissecar o coração para isolar o ventrículo esquerdo e usar lâminas de barbear retangulares para cortar o ventrículo esquerdo em blocos de um a dois centímetros cubos.
Reserve um bloco de tecido para cortar e coloque os pedaços restantes do bloco de tecido em um tubo de 50 mililitros de solução de Tyrode fria no gelo. Massageie suavemente o bloco de tecido reservado e adicione uma a duas gotas de cola de tecido ao suporte de amostra metálica do vibratome. Coloque um pedaço de bloco de 4% de ágar com uma área de superfície de aproximadamente um centímetro quadrado à cola e adicione uma a duas gotas de cola de tecido ao ágar.
Conecte o bloco cardíaco ao lado do epicardium cardíaco de ágar para baixo com o tecido o mais plano possível contra o suporte e coloque o suporte do tecido com o bloco cardíaco no banho de corte do vibratome. É crucial colocar o bloco cardíaco no ágar com o lado epicardium cardíaco voltado para baixo na cola do tecido e para ter certeza de que o tecido é o mais plano possível. Em seguida, conecte o tubo de oxigênio ao banho de corte e à bandeja de metal cheia de solução de Tyrode e coloque 40 filtros de células de micrômetro na bandeja de metal para coletar as seções do tecido cardíaco à medida que são fatiadas.
Use o software operacional vibratome para ajustar a altura da lâmina e a amostra para que a lâmina esteja perto da parte superior do tecido, mas abaixo dos músculos papilares e líquidos está cobrindo o tecido e a lâmina. Selecione o avanço para ajustar onde começar a cortar o tecido. Pressione a fatia para aumentar a velocidade e use o botão para mover a lâmina em direção à borda do tecido.
Pressione a fatia novamente para parar e avançar para inativar o processo. Em seguida, ajuste os parâmetros de corte conforme indicado e pressione a fatia para começar a cortar o tecido. Quando a lâmina atingir a extremidade do tecido, mas antes de atingir a extremidade do suporte do espécime, pressione a fatia novamente para parar e pressione voltar para voltar à posição inicial.
Quando as fatias atingirem o comprimento total e parecerem de boa qualidade, use uma pipeta pasteur de plástico cheia de solução de Tyrode fria para coletar suavemente o tecido do banho usando fórceps e tesouras de mola para deslocar a fatia do coração conforme necessário. Coloque cada fatia coletada em um único coador de células no banho de Tyrode oxigenado e use a solução na pipeta para pressionar o tecido na superfície do coador celular. Em seguida, coloque uma arruela de metal na parte superior do tecido para segurá-lo.
Depois de pelo menos uma hora em solução de Tyrode oxigenada, corte o exterior de cada fatia para remover quaisquer bordas irregulares e cole a extremidade de cada fatia em um pedaço de seis milímetros de largura de correia de cronometragem de impressora poliuretano esterilizada com fios metálicos incorporados. Coloque as fatias de coração apoiadas em placas de seis poços contendo seis mililitros de cultura média por poço e use fórceps estéreis para se certificar de que o tecido está no centro do poço. Tome cuidado para que a tampa da placa não toque no tecido e coloque a placa sobre a placa de cultura de modo que o lado curvo da tampa da placa combine com o lado angular da placa e que os cantos quadrados se alinham.
Coloque as fatias em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Substitua os supernacantes culturais por seis mililitros de cultura oxigenada fresca três vezes por dia. Conecte a tampa ao estimulador elétrico da cultura celular e ajuste o estimulador para fornecer continuamente 10 volts de eletricidade e uma frequência de 1,2 hertz às fatias do coração.
Depois de ligar a estimulação, as fatias do coração começarão a bater. Todos os dias durante a mudança de mídia do meio-dia, substitua a tampa da placa de estimulação do prato de cultura para evitar a liberação de partículas de grafite tóxico no meio da cultura. Insira o plugue de espuma branca onde a tampa usada se conecta ao cabo para o estimulador elétrico de cultura celular para evitar danos à água no circuito elétrico e coloque a tampa da placa em um banho de água autoclavada suplementada com antibiótico/antimíctico 2X.
No dia seguinte, descontaminar a tampa da placa em um banho de 70% de etanol por cinco a 15 minutos antes de transferir a tampa para um banho de água autoclaved fresco complementado com antibiótico 2X/antimíctico por três minutos. Depois de enxaguar a tampa da placa, use um lenço limpo sem fiapos limpos pulverizado com etanol para remover qualquer água residual das partes plásticas e remover o plugue de espuma branca. A capa está então pronta para ser colocada de volta na placa de cultura.
Utilizando esta nova configuração de cultura biomimética como demonstrado, a viabilidade das fatias de coração de porco foi mantida por seis dias, conforme avaliado pelo ensaio MTT. Nos primeiros seis dias, semelhante às respostas observadas para fatias de coração fresco, não há transitórios espontâneos de cálcio dentro dos cardiomiócitos de fatia de coração de porco. Os cardiomiócitos responderam à estimulação elétrica e beta-adrenérgica externa.
Além disso, a força contratil e as respostas ao isoproterenol foram mantidas na cultura de fatias cardíacas por até seis dias semelhantes às observadas em fatias de coração fresco. Várias avaliações estruturais e funcionais podem ser realizadas nas fatias cardíacas, incluindo ensaios de viabilidade de MTT, imunostaining, microscopia eletrônica, medidas transitórias de cálcio, avaliações de funções contratuais, avaliações metabólicas e análises. Estamos atualmente usando este sistema cultural para testar a toxicidade cardíaca aguda e eficácia de drogas e terapias genéticas de interesse em fatias de porcos e corações humanos.
