Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIGMS-074696) para KAM e uma Sociedade Americana de Microbiologia Robert D. Watkins Graduate Student Fellowship de Pesquisa de JLA Agradecemos também John Glover, da Universidade de Toronto para a prestação do FFL -GFP plasmídeo fonte.

1. Construção de variantes que contêm FFL-GFP plasmídeo Para este estudo, Saccharomyces cerevisiae BY4741 tensão (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) foi utilizado juntamente com uma cepa de exclusão Hsp104 da coleção nocaute levedura (Abrir Biosystems / Thermo Scientific). A deleção foi confirmado utilizando um anticorpo específico de Hsp104 para análise de Western blot. FFL-GFP foi expresso a partir de p426MET25-FFL-GFP, construído a partir de uma fonte baseada em plasmídeo LEU2 obtido a partir do laboratório de Glover na Universidade de Toronto, 17 e que se obteria com os autores do pedido. A expressão da proteína GFP-FFL plasmídeo de fusão é controlada pelo promotor MET25 metionina-reprimível. O plasmídeo foi transformado em cada cepa usando um protocolo foi adaptado do Gietz et. al, 1995: <ol><li> Centrifugar 25 ml o<html> f as células em fase log em um tubo de 50 ml a 4400 rpm durante 2 min, lava-se com 500 ul de duplo H 2 0 destilada (ddH2O), e descartar sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 250 ul de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, 0,1 M de acetato de lítio). Incubar a 30 ° C sem mistura durante 20 min. </li><li> Transferir 50 uL de células competentes para um novo tubo, juntamente com 5 mL (50 ug) de ADN transportador e 5 ul (0,1-5 ug) do ADN do plasmídeo. Adicionar 300 uL de PEG / TE / LiAc (o mesmo que TE / LiAc acrescido de 40% de polietilenoglicol) a esta mistura, e as células a incubar a 30 ° C por mais 30 min. </li><li> Adicione 1/10 de volume (v / v) de DMSO (36 mL) a esta mistura e choque térmico a 42 ° C durante 6 min. </li><li> Centrifugar mistura a 6.000 rpm por 30 segundos e remove sobrenadante. Ressuspender as células em 100 ul de ddH 2 0 e células de chapa estéreis em meio sintético completo sem uracilo (SC-ura). </li></ol> 2. Indução de FFL-GFP nt &quot;&gt; FFL-GFP é induzida uma vez que as células estão na fase de log para a maioria da proteína antes de choque térmico foi recentemente feito para evitar que as proteínas agregadas terminais ao longo do tempo devido a deficiências associadas com o envelhecimento celular. <ol><li> Dia 1: Incubar as células em 5 ml de SC-ura a 30 ° C rotativa S / N. </li><li> Dia 2: Medida de DO600 e inocular culturas frescas em 5 ml de SC-URA 600 ~ 0,2 OD. </li><li> Incubar as culturas com rotação a 30 ° C até atingirem a fase de log de ​​0,8-1,0 OD 600 ~. </li><li> Centrifugar as células em tubos cónicos de 15 ml a 4400 rpm, durante 3 min, decanta sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 500 ul de ddH 2 0; solução de transferência para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 6.000 rpm e descartar sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 5 ml de SC-URA-MET. As células devem ser incubadas rotativo neste meio durante 1 hora a 30 ° C. </li><li> Células centrífuga e lavagem de repetição em DDH 2 0 e descartar sobrenadante. </li><li> Resuspecélulas ª em 5 ml de mídia SC-Ura contendo 100 mg / ml de cicloheximida para inibir a expressão de proteínas e prosseguir imediatamente para a Etapa 3. </li></ol> 3. Enzimática FFL-GFP Ensaio de recuperação Este ensaio é um método quantitativo para determinar os níveis de enzima activa numa população. <ol><li> Preparação para este ensaio: <ol class="lroman"><li> Medir DO600 para cada amostra. </li><li> Preparar a quantidade necessária de D-luciferina necessário, com base no número de amostras e do número de repetições, mais cerca de 1200 ul de tubagem desejado. A concentração final de D-luciferina é de ~ 23 ug por 100 ul de células. Inicialmente, é dissolvido em água a uma concentração de solução de estoque de 7,5 mg / ml e diluído para 455 ug / ml em SC antes da experiência. Na Figura 2, três réplicas para cada amostra foram analisadas resultou num total de 2,4 ml de D-luciferina sendo usado. </li><li> Programa leitor de placa para o flash lumiensaio nescence (adaptado de BioTek Gen5 &quot;luminescência Ensaio do Flash com Injection&quot;, para outros instrumentos de seguir as instruções do fabricante) <ol class="lalpha"><li> Ajustar a temperatura a 30 ° C </li><li> Definir leitor de placas para adicionar D-luciferina, agitar e ler cada poço individualmente. </li><li> Leia luminescência (leitura de endpoint, 5 seg tempo de integração, 180 níveis de sensibilidade) </li><li> Para o ensaio de recuperação entre cada shake de leitura para 5 min, demora 20 min, e agitar um adicional de 5 min. </li><li> Pipetar 50 ul de D-luciferina a partir de um injector. </li></ol></li></ol></li><li> Luminescência Pré-aqueça-choque é medido imediatamente após as células são adicionadas ao meio contendo cicloheximida para interromper a síntese de proteínas. <ol class="lroman"><li> Transferir 100 uL de células para cada amostra com o número desejado de repetições em uma placa de 96 poços branca sólida. </li><li> Os controlos devem incluir um espaço em branco de água e as células contendo um vetor vazio. </li><li> Inicie a leitura com o SPEcações acima listadas. </li></ol></li><li> Para desnaturar a porção de FFL FFL-GFP, incubar a 5 ml de cultura num tubo de cultura de vidro a 42 ° C com agitação durante 25 min. </li><li> Recuperação de leituras do ensaio de luminescência começar imediatamente após as células são removidas da incubadora, o que é o ponto de tempo zero. Medida luminescência mesmo como descrito acima para o primeiro ponto de tempo e a cada 30 min durante 90 min. </li><li> Normalizar amostras para pré-aquecer-choque valores de luminescência que foram atualizadas com base na OD 600 (dividir os valores pré-aquecer-choque por OD 600). </li></ol> 4. Microscopia por fluorescência Este ensaio é um método semi-quantitativo para determinar a solubilização de agregados ao longo do tempo, numa população de células. <ol><li> A indução é o mesmo como descrito na secção 2, Passos 1-8 de protocolos. </li><li> Os mesmos pontos de tempo são tomados como descrito acima (secção 3, Passo 4), mas para microscopy recolher 1 ml de células de pré-aquecer-choque e cada ponto de tempo de recuperação e as amostras a incubar em rotação a 30 ° C num tubo de cultura. </li><li> Visualização: <ol class="lroman"><li> Centrifugar 1 ml de células a 6.000 rpm por 30 segundos e remove sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 2 mL de DDH 2 O. </li><li> Misturar 2 pi de células mais 2 mL de 2% de agarose de baixo ponto de fusão sobre a lâmina e adicionar uma lamela de cobertura. De modo a obter um único plano em células pressionar ligeiramente o dedo para baixo no centro da lâmina de cobertura e rodar até que a lâmina de cobertura é difícil de se mover. </li><li> Células são visualizadas usando objectivo óleo 100X em microscópio fluorescente; usam DIC para visualizar as células e o filtro FITC para visualizar fluorescência da GFP. </li><li> Tirar várias fotos para cada estirpe em cada momento para a quantificação. Campos para fotos devem conter ~ 15-30 células para análise pós-experimental quantitativa. </li><li> Para calcular a porcentagem de células que contêm agregados, conte 50Células -100 total e dividir o número de células que contêm agregados. </li></ol></li></ol> 5. Microscopia de uma única célula Este método é utilizado para seguir a solubilização de agregados individuais numa única célula ao longo do tempo. <ol><li> Induzir a expressão FFL-GFP, conforme descrito na Seção 2, as etapas 1-8. </li><li> Depois de choque térmico, as células de centrífuga de 15 ml em tubo cônico de 4.400 rpm por 2 min. </li><li> Lavar as células com 500 ul de água e ressuspender em 20 ml de ddH 2 O. </li><li> Para cada estirpe, cortar uma secção de uma placa de agar SC-URA 5x5 mm e utilizando a superfície que esteve em contacto com uma placa de Petri, pipeta 4 ul de células e propagação em torno da superfície de agar com pipeta. Deixe repousar por ~ 1 min. </li><li> Use uma pinça para colocar seção cubo agar virado para baixo sobre a ~ 55 milímetros de vidro de fundo prato No. 0 e pressione levemente. </li><li> Visualização: <ol class="lroman"><li> Veja i-iii em Sectião 4. </li><li> Definir coordenadas para 2-4 pontos focais para cada cepa, dependendo da densidade da cultura. </li><li> Definir câmera para tirar fotos com um Z-stack com escala apropriada (- / + 15 mm, com uma espessura de corte de 0,5-1,0 mM) a cada 5 min, por um período de 90 min. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo, a proteína modelo FFL-GFP foi usado para mostrar que o disaggregase levedura, a proteína Hsp104 contribui para a re-solubilização e reparação. Os ensaios enzimáticos e microscopia diferencialmente interrogado o estado da mesma proteína substrato para determinar a eficiência de redobragem e rendimento. Os resultados dos ensaios enzimáticos sugerem que a recuperação não é só a recuperação máxima na estirpe mutante hsp104D ineficiente, mas o valor inicial da tensão de desdobramento...

Nos seres humanos, incluindo distúrbios neurodegenerativos doença de Alzheimer e de Parkinson, e doença de Huntington tem sido associada ao enrolamento incorrecto e agregação das proteínas 10. Células empregar chaperones moleculares para evitar armadilhas cinética de proteínas celulares em estruturas inativas deformadas 6. As chaperonas participar em redes de interacção intrincados dentro da célula, mas não está completamente compreendido como a soma destas interacções contribui para Proteostase organismos. Uma das principais chaperonas responsáveis ​​pela maioria da dobragem de proteína citosólica é a 70 kD da proteína de choque térmico (Hsp 70) 19 família. Tem sido demonstrado que a perda de levedura de Hsp70 diminui a capacidade de dobrar nascente FFL heterologamente expressos e redobrar a proteína endógena, ornitina transcarbamilase, in vivo, 18, ​​7. A capacidade de analisar dobrável com resolução de tempo quase real irá facilitar a compreensão de como fatores de celular cont adicionalribute para este processo de Hsp70-dependente. Além disso, dobrando / redobrando reações podem não ser completamente dependente destas proteínas contribuem, de modo ensaios deve ser sensível o suficiente para detectar pequenas e grandes mudanças na cinética e eficiência. O disaggregase célula de levedura, Hsp104, desempenha um papel vital na reparação de proteínas deformadas agregados. Embora Hsp104 homólogos foram identificados em fungos e plantas, esta família parece estar ausente no metazoários. Tem sido proposto que outras chaperonas como os da família Hsp110 executar algumas das actividades conhecidas Hsp104 em mamíferos 16. Hsp104 é um +, complexo de proteínas hexamérica AAA que funciona em levedura para agregados de proteína remodelar, contribuindo para refolding e reparação 13. Hsp104, juntamente com a levedura de Hsp70, SSA1, ea levedura Hsp40, Ydj1, é necessária para a recuperação de FFL desnaturado em células de levedura 5, 8. A pequena proteína de choque térmico, Hsp26, também tem sido demonstrado ser requivermelho para a desagregação Hsp104 mediada por FFL 2. FFL é uma proteína de duas domínio que se liga ao substrato luciferina no local activo e sequência de uma alteração conformacional que requer ATP e de oxigénio, o substrato libertando decarboxylates oxiluciferina, o dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), e luz 11, 9, 3. O substrato comercialmente disponível FFL, D-luciferina, resulta em emissão de luz entre 550-570 nm, que podem ser detectadas usando um luminómetro 15. FFL é extremamente sensível à desnaturação de tratamentos e agregados rapidamente químicas ou calor em cima de desdobramento. Quando exposto a temperaturas entre 39-45 ° C FFL é reversível desdobrado e inativada 12. Em contraste, a GFP e seus derivados são altamente resistentes à proteína desdobramento tensões 14. Portanto fusão destas duas proteínas permite FFL para funcionar como uma unidade experimentalmente lábil capaz de atingir funcional LPF para depósitos intracelulares que podem ser visualizados por microscopia de fluorescência, tanto a população e os níveis de células individuais. Aplicação do ensaio enzimático num leitor de placas multimodo semi-automatizada juntamente com microscopia automatizada permite a avaliação simultânea sem precedentes de cinética e rendimento de reacções de redobramento. Além disso, a genética molecular fácil do modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto a manipulação precisa da rede de controlo de qualidade de proteínas e a oportunidade para que as abordagens baseadas em descoberta para identificar novos jogadores contribuem para a resposta ao stress celular e Proteostase. Neste estudo, os de tipo selvagem (WT) e Hsp104 supressão estirpes que expressam FFL-GFP estão sujeitas a desnaturação da proteína de choque térmico. FFL-GFP refolding é monitorado através de um ensaio de enzimática e microscopia como uma leitura proxy para reparação do proteoma expresso ao longo de um curso de tempo de recuperação. Quando comparadas com as células WT, vamos mostrar ºe Hsp104 tensão eliminação é de aproximadamente 60% ​​menos eficiente na redobrando FFL-GFP, apoiando resultados anteriores estabelecer um papel para Hsp104 na reativação da desnaturado FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostase, definidos como os processos combinados de proteína de dobragem / biogénese, redobragem / reparação e degradação, é um equilíbrio celular delicada que deve ser mantida para evitar consequências deletérias 1. Fatores externos ou internos que perturbam esse equilíbrio pode levar a agregação de proteínas, toxicidade e morte celular. Nos humanos este é um factor que contribui para os sintomas associados com doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Huntington, doença de Parkinson, e doença de Alzheimer 10. Por conseguinte, é essencial que as proteínas envolvidas na manutenção da Proteostase ser identificados a fim de desenvolver tratamentos para estas doenças debilitantes. Este artigo descreve as técnicas para monitoramento de enovelamento de proteínas vivo na resolução de tempo quase real, utilizando o modelo de proteína firefly luciferase fundida a proteína verde fluorescente (GFP-FFL). FFL-GFP é um modelo de proteína quimérica única como o radical FFL é extremamente sensível ao stress induzido misfolding e agregação, que inactiva a enzima 12. A actividade da luciferase é monitorizada usando um ensaio enzimático, e a porção da GFP fornece um método de visualização FFL solúvel ou agregado usando microscopia automatizado. Estes métodos juntamente incorporar duas abordagens paralelas e tecnicamente independente para analisar tanto refolding e reativação funcional de uma enzima após o estresse. Recuperação da atividade pode ser diretamente correlacionada com a cinética de desagregação e re-solubilização para entender melhor como fatores de controle de qualidade de proteína, como chaperones proteína colaborar para executar essas funções. Além disso, as deleções ou mutações de genes podem ser usadas para testar as contribuições de proteínas específicas ou subunidades proteicas para este processo. Neste artigo, vamos examinar as contribuições da proteína disaggregase Hsp104 13, conhecida com a parceria com o fator de troca Hsp40/70/nucleotide (NEF) redobrando sistema 5, a proteína refolding para validar esta abordagem.

A levedura é dependente da disaggregase, Hsp104 redobrar eficientemente proteínas desnaturadas pelo calor. A atividade de FFL-GFP foi monitorado após um choque de 25 min de calor, através de um ensaio de flash luminescência Figura 1. Os resultados deste ensaio automático mostrado na Figura 2 revelou um aumento progressivo na actividade ao longo de 90 min, que levou a uma recuperação de&gt; 80% em células WT. A tensão hsp104Δ recuperou 19% da atividade original em rel...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para investigar<em&gt; In vivo</em&gt; Dobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Usando estes reagentes, redobrando de um modelo de proteína desnaturada pelo calor pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência em simultâneo e um ensaio enzimático para sondar as funções dos componentes da rede Proteostase no controlo de qualidade de proteínas.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K visualizações.  University of Texas Medical School. Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para investigar In vivo Dobramento de proteínas em Saccharomyces cerevisiae. Usando estes reagentes, redobrando de um modelo de proteína desnaturada pelo calor pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência em simultâneo e um ensaio enzimático para sondar as funções dos componentes da rede Proteostase no controlo de qualidade de proteínas.

Vídeo: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em