Este trabalho foi financiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde e do Instituto de Pesquisas Beckman da Cidade da Esperança. Gostaríamos de agradecer aos revisores por seus comentários construtivos que acrescentou clareza ao manuscrito.

1. HO-estimulado freqüências translocação <ol><li> Inocular 20/10 independentes 1 ml de culturas YPGly / Lac médio (1% extrato de levedura, peptona 2%, glicerol 3% e lactato de 3%) com colônias único do genótipo desejado. Incubar as culturas durante a noite, ou durante o tempo necessário para chegar a uma densidade celular de cerca de 5x10 7-1x10 8 células / ml, a 30 ° C em um rotador, ou com agitação suave. </li><li> Adicionar galactose para as culturas para uma concentração final de 2% para induzir HO endonuclease-dirigido LAP no his3-Δ3 &#39;(cromossomo III) e his3-Δ5&#39; (cromossomo XV) substratos de translocação. </li><li> Incubar durante 4 h, a 30 ° C em um rotador, ou com agitação suave. </li><li> Após 4 h, placa diluições apropriadas das culturas em YPD (1% extrato de levedura, peptona 2%, dextrose 2%) para produzir cerca de 100 a 200 colônias por placa, e um número suficiente de células para histidina médio faltando para produzir um observável número de colônias Sua + recombinante. Incubar as placas a 30 ° C por 2-3 dias. </li></ol> NOTA: Passo 1,4 descreve a determinação de freqüências de translocação em condições por plaqueamento seletivo para as culturas histidina falta médio. Este ensaio também pode ser realizado sob condições não-seletivo por plaqueamento culturas em YPD, em seguida, replica-plating as colônias que surgem onto-Seus pratos 2-3 dias depois. Esses métodos produzem freqüências semelhantes de translocação (Figura 2C). <ol start="5"><li> Determinar a freqüência de translocação pela divisão do número de colônias prototrophic histidina pelo número total de células viáveis ​​banhado (determinada por meio de diluições em placas YPD). Determinar a freqüência de translocação mediana e intervalo de confiança 95% 15. </li></ol> 2. Eficiências de chapeamento <ol><li> Retire uma alíquota de células de cada cultura durante a noite, e determinar o número de células por hemocitômetro count (Baxter Healthcare Corporation catolog #:. B3178-1). </li><li> Placa de aproximadamente 100 a 200 células utilizando uma diluição adequada em YPD. Incubar por 2-3 dias a 30 ° C (por exemplo, para uma cultura com uma densidade celular de 1x10 8 células / ml, deve-se placa de 100-200 mL de uma diluição 10-5 por placa). </li><li> Adicionar galactose 20% para as culturas para uma concentração final de 2%. </li><li> Após 4 h, retire uma alíquota de células de cada cultura, determinar o número de células por contagem de hemocitômetro, e placa de aproximadamente 100 a 200 células utilizando uma diluição adequada em YPD. Incubar por 2-3 dias a 30 ° C. </li><li> Determinar a eficiência plating pela divisão do número de colônias aparecendo em YPD pelo número de células banhado, e multiplicando este quociente por 100. Determinar a percentagem mediana, com um intervalo de confiança de 95%. </li></ol> 3. Blot genômico do Sul <ol><li> Selecione uma única colônia Sua + recombinante de cada um julgamento independente e preparar o DNA genômico 16. </li><li> Digest aproximadamente 4 mg de DNA com endonuclease de restrição BamHI. </li><li> BamHI separados digerida fragmentos em um gel de agarose 0,7%, e transferir para uma membrana de nylon com carga positiva (+ N Hybond, a GE Healthcare Código do Produto:. RPN303B) 17. </li><li> Hibridizar com 32 sonda P-rotulados obtidos por priming random (Amersham Biosciences Código do Produto:. RPN1604) com um 1,8 kb clone BamHI / BamHI genômica contendo o gene HIS3. </li><li> Visualize fragmentos de DNA por autoradiografia ou phosphorimaging. </li></ol> 4. Análise de cromossomos blot usando cromossomos separados em um contorno-fixada campo elétrico homogêneo (CHEF): <ol><li> Prepare cromossomos de selecionados recombinantes Sua + em plugs de agarose 18: <ul><li> Crescer uma cultura líquido do seu candidato + TXV:: III cromossomo contendo recombinante em 5 ml de YPD para cerca de 1-2 x 10 8 células / ml. </li><li> Spin para baixo e lavar as células duas vezes com 50 mM EDTA. </li><li> Ressuspender as células em cerca de 200 mL de EDTA 50 mM, e aquecer a 50 ° C. </li><li> Adicionar um volume igual de fundição de 2% (w / v) baixo derreta agarose trouxe a 50 ° C, misturar bem. </li><li> Dispensar cerca de 80 alíquotas mL em moldes plug, e deixe esfriar por 30 min a 4 ° C. </li><li> Extrude plugs do molde em um prato de 12 também. Até cinco velas podem ser colocadas em cada poço. </li><li> Adicionar 3 ml de solução recém-preparada spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M Sorbitol) para cada poço. Incubar a 37 ° C por 4 horas com agitação suave. </li><li> Remoção da solução spheroplasting e substituir com 3 ml de solução de LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) dodecil sulfato de lítio, regulávelt pH a 8,0). Incubar a 37 ° C por 15 min com agitação suave. </li><li> Remoção da solução de LDS e substituir com outra alíquota de 3 ml de LDS. Incubar a 37 ° C durante a noite com agitação suave. </li><li> Remover e substituir LDS com 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g Tris Base, 93 g EDTA dissódico di-hidratado, 5 g N-Lauroyl Sarcosine, ajustar o pH a 8.0, trouxe para 500 ml de dH 2 O). Incubar a temperatura ambiente por 30 min com agitação suave. Remover NDS, e repita duas vezes. </li><li> Remover e substituir NDS com 3 ml TE. Lavar com agitação suave durante 30 min à temperatura ambiente. Repita 4 vezes. </li><li> Loja plugs a 4 ° C em 2 ml de TE. Plugs pode manter por até um ano. </li></ul></li><li> Cromossomos separados em um gel 1% agarose usando um Bio-Rad aparelho CHEF-DRII menos 14 ° C (Catalog #: 170-3612). </li></ol> Parâmetros: 1 º Bloco: 70 tempo switch, 15h às 6V/cm. 2 Bloco nd: interruptor de tempo 120s, 11h às 6V/cm <ol start="3"><li> Visualize os cromossomos através da coloração com brometo de etídio 1μg/ml por 30 min, irradiando com 60 mJ de UV em uma Stratalinker UV (Stratagene), e de coloração por 30 min em dH 2 O. Irradiando cromossomos brometo de etídio nicks manchou o DNA para permitir a transferência eficiente para a membrana. </li><li> Transferência de cromossomos de uma membrana com carga positiva (+ N Hybond, a GE Healthcare Código do Produto:. RPN303B) por ação capilar em condições de desnaturação (0.4N NaOH, 1,5 M NaCl). </li><li> Hibridizar com 32 sonda P-rotulados obtidos por priming random (Amersham Biosciences Código do Produto:. RPN1604) com um clone genômico 1,8 kb BamHI / BamHI contendo o gene HIS3 17. </li><li> Visualize cromossomos por autoradiografia ou phosphorimaging. </li></ol> 5. Resultados representativos: A representação gráfica do ensaio de translocação é representada no nível cromossômico (Figura 1). Um esquema do procedimento experimental também é exibido (Figura 2A). Pré e pós-indução eficiência revestimento são determinadas pela divisão do número total de células viáveis, formadoras de colónias pelo número total de corpos celulares na cultura determinada por hemocitômetro count (Figura 4B). Pré e pós-indução eficiência revestimento não foram significativamente diferentes para as células do tipo selvagem (p-valor = 0,1400) (Tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Pré e pós-indução eficiência revestimento em células do tipo selvagem. um número de corpos celulares por mililitro são determinadas pela contagem de hemocitômetro. b O número de células viáveis ​​por mililitro são determinados por plaqueamento diluições apropriadas em meio não selectivo para produzir ~ 100-200 colônias. c O pré e pós-indução eficiência revestimento são determinadas pela divisão do número total de viáveis, formadoras de colônia, as células pelo número total de corpos celulares na cultura, determinado pela contagem de hemocitômetro. Isto sugere que a presença ou ausência de um cromossomo translocação não afeta a capacidade de sobreviver a formação de DSB. A freqüência de translocações cromossômicas pode ser calculado dividindo o número de colônias prototrophic histidina pelo número total de células viáveis ​​determinadas por plaqueamento em YPD (Figura 2B). Este ensaio pode ser realizado utilizando cepas do genótipo diferentes para identificar como a perda da função da proteína afeta SSA (ie rad51Δ - / -). Freqüências de recombinação determinado em diferentes linhagens podem ser traçadas para comparar as diferenças na capacidade dessas cepas para reparar o LAP HO-endonuclease induzida pela SSA (Figura 2C). Translocação freqüências obtidas com a cepa diplóide tipo selvagem em seletiva (2.2x10 -2) e não-seletiva (2.17x10 -2) condições não foram estatisticamente diferentes entre si (p-valor = 0,9131), enquanto as freqüências obtidas seletivamente translocação (6.0x10 -2) e não-seletiva (11.9x10 -2) com a rad51Δ - / - homozigoto foram semelhantes, mas estatisticamente diferentes (p = 0,0089). As freqüências obtidas tanto seletivamente (p = 0,0001) e não-seletiva (p = 0,0002), com o ° Rad51 - / - homozigoto foram estatisticamente diferentes daqueles obtidos com as respectivas condições com a cepa do tipo selvagem. Putativa translocação de rolamento clones pode ser examinado por Southern blot e análise genômica blot cromossômicas (Figura 3). Para a análise do Sul, o DNA genômico é digerido com BamHI endonuclease antes de eletroforese em gel de agarose, blotting e hibridação para um 32P-rotulados 1.8kb sonda HIS3 para visualizar o diagnóstico 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb TIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5&#39; fragmentos (Figura 3B.1) . Cromossomos intactos podem ser preparados, separados por CHEF (Figura 3B.2), apagados para nylon e hibridizados com os 32 P-rotulados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar a 1,1 Mb intacta cromossomo XV, 0,8 Mb TXV: III cromossomo translocação, 0,6 Mb TIII: XV cromossomo translocação, e 0,3 Mb intacta cromossomo III (Figura 3B.3). Um mapa gráfico representando esperado endonuclease BamHI-digerido fragmentos de DNA genômico, e pai e cromossomos recombinantes, é descrito (Figura 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formação de cromossomos translocação pela vertente única annealing (SSA). 1) LAP são criados no his3-Δ3 e his3-Δ5 &#39;substratos (cromossomos XV e III, respectivamente) pela endonuclease HO após a adição de galactose para as culturas. 2) LAP são processados ​​para gerar 3 &#39;single-fios nas extremidades dos cromossomos quebrados. 3) SSA anneals 311 máquinas complementares ou 60 nucleotídeos single-stranded HIS3 seqüências formadas em cada um dos substratos de recombinação. Não-homólogos caudas formada a partir de recozimento são removidos por digestão endonuclease. Complementares quatro saliências bp nos fragmentos remanescentes cromossômicas formado por HO-endonuclease digestão também podem anneal. 4) Ligadura conclui a criação de um gene intacto HIS3 e TXV:: III cromossomo translocação pela SSA. Células que carregam esse cromossomo pode ser selecionado por sua capacidade de crescer em histidina falta médio. Ligadura também pode gerar o TIII recíproca:: XV cromossomo translocação por um mecanismo NHEJ-like. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ensaio para determinar a freqüência de translocação de SSA. A) Um ml YPGly / Lac culturas são inoculadas com colônias única de células de um genótipo selecionar e cresceu para uma densidade adequada de cerca de 5x10 7-1x10 8 células / ml. Galactose é adicionada a uma concentração final de 2% para criar LAP na substratos recombinação nos cromossomos III e XV. Para realizar o ensaio em condições seletivas, diluições apropriadas são feitas de tal forma que aproximadamente 100 a 200 células são banhados em YPD e um número suficiente de células são banhados em histidina falta de rendimento médio e um número de colônias observáveis ​​Sua + recombinante. Para realizar o ensaio, sem seleção, cerca de 100 a 200 células são banhados em YPD, cultivados por dois a três dias para as colônias individuais e, em seguida, replica banhado em histidina meio faltando. B) Translocação freqüência pode ser determinado pela divisão do número de colônias que crescem on-Seus pratos pela fração que crescem em YPD. C) A freqüência de translocação de estirpes do genótipo diferente (ou seja do tipo selvagem e rad51Δ - / -) podem ser representados graficamente para comparar as diferenças na capacidade dessas cepas para reparar o LAP pela SSA. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Determinar a eficiência de galvanização. (A) Uma alíquota de células é retirado da cultura durante a noite antes e após a indução DSB, diluições apropriadas são feitas, seguido por uma contagem hemocitômetro para determinar o número total de corpos celulares por ml de cultura. Diluições apropriadas são semeados em meio não selectivo para determinar o número total de células viáveis ​​por ml, pela contagem de colônias que aparecem em YPD. (B) A eficiência revestimento é então determinado pela divisão do número total de células viáveis ​​pelo número total de corpos celulares, e multiplicando este quociente por 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Detecção de eventos de translocação cromossômica por Southern blot e análise genômica blot cromossomo. A) Representação gráfica de cromossomos relevantes antes (esquerda) e depois (direita) a formação de translocação. Tamanhos de pai e cromossomos recombinantes estão listados na megabase-pares (Mb). Tamanhos de fragmentos de restrição contendo seqüências relevantes gerados por BamHI digestão de DNA genômico do pai e linhagens recombinantes, e revelou em blots de hibridização com uma BamHI kb 1,8 clone HIS3 genômica, estão listados na kilobase-pares (kb). Cromossomos não estão em escala. B) a análise física do suposto translocação de suporte de clones. (1) blot Genomic do Sul - O DNA genômico foi coletado e submetido à digestão com endonuclease de restrição BamHI, fracionados por eletroforese em gel, bloenquadrados de nylon e hibridizados para um 32 kb 1,8 P-rotulados HIS3 sonda para visualizar os fragmentos seguintes: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb TIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5 &#39;. Lanes: a) diplóides pai, b) + Sua translocação não-recíprocas recombinantes, c) Sua translocação recíproca + recombinante. (2) CHEF géis - cromossomos intactos foram preparadas em plugs de agarose, separados por CHEF, corado com brometo de etídio e visualizados sob luz UV. Lanes: Como acima. (3) blots Cromossômicos - Separado cromossomos foram apagados de nylon e hibridizados com os 32 1,8 kb P-rotulados HIS3 sonda para visualizar os cromossomos seguintes: 1.1 Mb intacta cromossomo XV, 0,8 Mb TXV: III cromossomo translocação, 0,6 Mb TIII: translocação XV cromossomo, e 0,3 Mb intacta cromossomo III. Lanes: Como acima.

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	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Altas doses de radiação ionizante apresentam um risco inerente de instabilidade do genoma através da geração de um grande número de LAP 19. Genomas eucarióticos estão repletos de seqüências repetitivas que são substratos excelentes para a geração de translocações e rearranjos genômicos outros 20,21. Translocações cromossômicas por HR são freqüentemente observadas quando LAP são introduzidas entre seqüências repetitivas 12,21,22. Esmagadora evidência sugere que grande parte da instabilidade genômica associada a leucemias e linfomas pode ser atribuído à translocações cromossômicas, destacando a importância de entender como este mecanismo ocorre em eucariotos 22,23. Nós desenvolvemos um sistema em levedura de brotamento para examinar a formação de cromossomos translocação por DSB-induzida FC entre regiões curtas de homologia em cromossomos diferentes que são semelhantes em tamanho para elementos repetitivos dispersos por todo o fermento e genomas humanos. No ensaio, o substrato his3-Δ3 &#39;translocação está localizado em uma cópia do cromossomo XV. O alelo his3 outros (his3-Δ200) tem uma deleção ~ 1kb do promotor HIS3 e seqüência de codificação que impede que essa seqüência de ser usado como um modelo para conserto 24. O substrato his3-Δ5 &#39;está localizado no locus LEU2 em uma cópia do cromossomo III, com a outra cópia do cromossomo III contendo um alelo LEU2 inalterado (Figura 1). A galactose induzível HO-cassete de expressão endonuclease marcados com KAN-MX foi inserido no lócus do cromossomo TRP1 IV (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Cada substrato translocação é ladeada por uma seqüência de reconhecimento HO-endonuclease que podem ser direcionados para a clivagem por induzir a expressão do gene HO através da adição de galactose para a mídia. Depois de HO-endonuclease clivagem induzidas na his3-Δ3 e his3-Δ5 &#39;substratos, as células podem usar eficientemente o trato compartilhada curto de HIS3 homologia de seqüência (311 bp e 60 bp) para reparar os cromossomos quebrados por HR, gerando um cromossomo translocação com um alelo HIS3 intacta 12-14,25. Porque as células-mãe falta uma cópia intacta do gene HIS3, eles são incapazes de crescer on-Sua médio. Apenas as células que sofreram o evento de translocação pode ser selecionado para histidina em falta média. Portanto, a freqüência de translocações cromossômicas pode ser calculado dividindo o número de colônias prototrophic histidina pelo número total de células viáveis ​​banhado, determinados por plaqueamento em YPD. DNA genômico e cromossomos intactos pode então ser isolada do representante colônias Sua +, ea presença de um cromossomo translocação verificada por Southern blot e análise genômica do cromossomo. Análise cuidadosa nos permitiu coletar informações adicionais importantes sobre o teste 12. Southern blot genômico apresentou elementos de prova que não há corte praticamente completo de cromossomos XV e III após 30 minutos de HO-endonuclease de indução, e, portanto, não há nenhum fundo significativo de uncut substratos cromossômicas na população (G. &amp; A. Bailis Manthey, resultados não publicados). Genômica análises de Southern blot e do cromossoma de Sua - indica que as células sobreviventes freqüentemente perdem um, o outro, ou ambos os cromossomos de corte e permanecem viáveis ​​(L. Liddell &amp; A. Bailis, resultados não publicados). Importante, a eficiência de plaqueamento quase equivalente em meio não selectivo, antes e após a indução da expressão da HO-endonuclease indica que nem o insucesso para reparar cromossomos quebrados, nem o fracasso de manter cromossomos translocação afeta a capacidade de sobreviver a formação de DSB. Consistente com isso, o TXV: III cromossomo translocação tem se mostrado instável em células mitóticas na ausência de seleção. Isso foi demonstrado pela crescente TXV:: III recombinantes contendo Sua + noite não-seletivamente, chapeamento de colônias única para não-seletivo placas, chapeamento e réplica em meio seletivo sem histidina. Dez a 70% das colônias resultantes dessas placas tinham perdido a TXV:: III cromossomo translocação (N. &amp; A. Bailis Pannunzio, resultados não publicados). Translocação cromossomos gerados pela exposição IR em seres humanos apresentam uma instabilidade semelhante 26. Isto sugere que a formação de translocação pode contribuir para eventos iniciais na tumorigênese através da promoção de perda de heterozigose. Segundo, extensas análises genéticas e moleculares sugerem que SSA, um mecanismo eficiente e obrigatoriamente não-conservadora de RH, é o principal mecanismo de formação de translocação de HR após a criação simultânea de LAP em dois cromossomos 12,27,28. Esta é consistent com a constatação de que grandes doses de resultado IR em uma densidade de LAP suficiente para criar quebras adjacente a múltiplas seqüências repetitivas no genoma da levedura, e uma alta freqüência de formação de translocação de RH. Juntas, essas observações sugerem que o efeito oncogênico de exposição IR nos seres humanos podem, em parte, resultam da reparação de LAP por um mecanismo eficiente de RH que gera translocações que, através de sua inerente instabilidade, promover mudanças genéticas que tumorigênese lançamento. Porque a radiação é muitas vezes utilizado para tratar câncer de rearranjos, genoma que resultam da reparação de radiação induzida por LAP pode contribuir para a geração de cânceres secundários que surgem com freqüência nos pacientes. Assim, este modelo pode nos ajudar a obter uma melhor compreensão da base genética e molecular de uma importante resposta clínica ao tratamento IR.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

Variação genética é freqüentemente mediada por rearranjos genômicos que surgem através da interação entre elementos repetitivos dispersos presente em cada genoma eucariótico. Este processo é um mecanismo importante para a geração de diversidade entre e dentro dos organismos 1-3. O genoma humano consiste em aproximadamente 40% repetitiva seqüência de origem retrotransposon, incluindo uma variedade de linhas e Sines 4. Eventos de intercâmbio entre esses elementos repetitivos podem levar a rearranjos do genoma, incluindo translocações, que podem perturbar dosagem do gene e expressão que pode resultar em doenças auto-imunes e cardiovasculares 5, bem como o câncer em seres humanos 6-9. Intercâmbio entre elementos repetitivos ocorre em uma variedade de maneiras. Intercâmbio entre as seqüências que compartilham homologia (ou quase perfeita) perfeito ocorre por um processo chamado recombinação homóloga (HR). Por outro lado, não homólogos final juntar (NHEJ) usa pouco-ou-não homologia de seqüência para a troca de 10,11. O objetivo principal do HR, em células mitóticas, é reparar quebras das fitas duplas (LAP) gerados endogenamente pela replicação do DNA aberrante e lesões oxidativas, ou por exposição à radiação ionizante (IR), e outros agentes nocivos DNA exógeno. No ensaio aqui descrito, LAP são simultaneamente criado fronteira com substratos de recombinação em dois diferentes loci cromossômicos em células diplóides por uma galactose induzível-HO-endonuclease (Figura 1). A reparação dos cromossomos quebrado gera translocações cromossômicas por único fio de recozimento (SSA), um processo no qual seqüências homólogas adjacentes às extremidades do cromossomo são covalentemente juntou subseqüente ao recozimento. Um dos substratos, his3-Δ3 &#39;, contém uma 3&#39; truncado HIS3 alelo e está localizado em uma cópia do cromossomo XV no locus HIS3 nativa. O segundo substrato, his3-Δ5 &#39;, está localizado no locus LEU2 em uma cópia do cromossomo III, e contém um 5&#39; truncado HIS3 alelo. Ambos os substratos são acompanhadas por um site de reconhecimento endonuclease HO que possam ser alvo de incisão por HO-endonuclease. Sites de endonuclease HO reconhecimento nativo ao locus MAT, em ambas as cópias do cromossomo III, foram suprimidos em todas as cepas. Isso evita que a interação entre os substratos de recombinação e outras extremidades dos cromossomas quebrados de interferir no ensaio. O KAN-MX-galactose marcada induzível HO-cassete de expressão endonuclease é inserida no locus TRP1 na IV cromossomo. A quota de substratos 311 bp e 60 pb da seqüência HIS3 de codificação que pode ser utilizado pela máquina de RH para a reparação por SSA. Células que usam estes substratos para reparar cromossomos quebrados por HR formar um alelo HIS3 intactas e uma TXV:: III translocação cromossômica que podem ser selecionados pela capacidade de crescer em meio sem histidina (Figura 2A). Freqüência de translocação por HR é calculado dividindo o número de colônias prototrophic histidina que surgem em meio seletivo pelo número total de células viáveis ​​que possam surgir após o plaqueamento diluições apropriadas em meio não selectivo (Figura 2B). Uma variedade de mutantes de reparo de DNA têm sido utilizados para estudar o controle genético da formação de translocação de SSA usando este sistema 12-14.

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Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

O ensaio de translocação HO-estimulado monitores vertente única de recozimento após a criação do DNA dupla fita-breaks em loci múltiplos em diplóides<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Este mecanismo pode modelo de rearranjos do genoma em células somáticas de eucariotos superiores após a exposição a altas doses de radiação ionizante.

Quantificação e análise da formação de HO-endonuclease Stimulated translocações cromossômicas por Strand Único Annealing em Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

14.6K visualizações.  Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences. O ensaio de translocação HO-estimulado monitores vertente única de recozimento após a criação do DNA dupla fita-breaks em loci múltiplos em diplóides Saccharomyces cerevisiae. Este mecanismo pode modelo de rearranjos do genoma em células somáticas de eucariotos superiores após a exposição a altas doses de radiação ionizante.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR Monitorado Redox Titulação de cofatores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...