Este protocolo descreve uma técnica para estudar o evento de cálcio evocado mecanicamente em uma preparação urotelial ex vivo. A técnica é relativamente fácil de executar e pode ser adaptada para estudar o evento de cálcio evocado mecanicamente em outras preparações de tecidos nativos. Fabrice as micropipetas colocando o vidro capilar no extrator e ajustando-o com os botões de retenção capilar.
Puxe o capilar de vidro em duas etapas, de acordo com as instruções do fabricante. Feche a ponta das micropipetas usando uma microforja com o botão de ajuste do aquecedor ajustado em 60. Depois de expor a bexiga e o osso pélvico do rato eutanasiado, quebre o osso pélvico para expor a uretra e canule a uretra com um cateter de calibre 24.
Use uma sutura 6-0 para prender o cateter à uretra. Colha a bexiga e a uretra e fixe-as em uma almofada de suporte de borracha de silicone banhada na solução de gravação. Separe a mucosa da bexiga da camada muscular subjacente com pinça fina.
Abra a mucosa da bexiga e fixe-a com o urotélio voltado para uma inserção de elastômero de silicone no fundo de um prato de cultura de tecido de 35 milímetros de diâmetro. Monte a placa de cultura de tecidos com a mucosa da bexiga fixada no estágio de microscópio equipada com uma incubadora de pratos de cultura com elementos de aquecimento resistivo. Perfundir o prato de cultura celular continuamente a uma taxa de 1,7 mililitro por minuto com uma solução de gravação aquecida a 37 graus Celsius com um aquecedor em linha.
Mantenha a temperatura da incubadora e das soluções de prato de tecido a aproximadamente 37 graus Celsius com um controlador de temperatura bipolar de canal duplo. Para registar os transientes de iões de cálcio induzidos mecanicamente, submerja a micropipeta na solução de registo. Sob iluminação de campo brilhante, usando uma objetiva de varredura de baixa ampliação, mova a micropipeta para o centro do campo.
Mova o micromanipulador no plano vertical e ajuste o foco para mover a pipeta perto da superfície do tecido urotelial. Mude para a objetiva com maior ampliação e abertura numérica adequada para imunofluorescência. Ajuste o micromanipulador para fino e mova a pipeta perto do topo da célula alvo.
Se necessário, ajuste o foco e a posição da pipeta. Abra o protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia e configure-o para jogar. Ajuste o foco e pressione start no gerenciador de experimentos para iniciar a aquisição de dados.
Isso aciona o atuador piezoelétrico e gera um arquivo com as imagens do experimento. Quando a célula é estimulada, observa-se um aumento na fluorescência. Para quantificar a intensidade fluorescente, abra o arquivo de imagem no software de imagem e selecione a janela de contagem e medida.
Reproduza o filme para identificar a célula estimulada. Selecione a ferramenta de polígono e desenhe um ROI nos limites da célula que foi cutucada. Vá para a janela de medição, selecione perfil de intensidade, defina a medição como horas extras, os resultados como média, a subtração em segundo plano como nenhuma e pressione executar.
A intensidade média de fluorescência será calculada ao longo do tempo. Para exportar os dados do perfil de intensidade, clique no ícone do Excel na janela de resultados do perfil de intensidade e realize a análise de dados usando gráficos científicos e software de análise de dados. Neste estudo, a célula guarda-chuva foi cutucada para avaliar os transientes de cálcio evocados mecanicamente.
A imagem capturada em 10 segundos mostra uma visão fluorescente da pipeta estimulante posicionada no topo de uma célula guarda-chuva expressando um sensor de cálcio fluorescente GCaMP5G. A estimulação mecânica da célula guarda-chuva que expressa o sensor de cálcio causa uma deformação seguida por um rápido aumento na emissão de fluorescência. O gráfico demonstra uma mudança na intensidade de fluorescência plotada em função do tempo para várias células.
A cutucada evoca uma resposta de cálcio na maioria das células guarda-chuva transduzidas com um sensor de cálcio fluorescente. O passo mais importante é colher a bexiga e a uretra, seguido de afixá-los a uma almofada de suporte de borracha de silicone. Evite danos nos tecidos ao separar a mucosa da bexiga da camada muscular subjacente.
Métodos de imagem como o descrito aqui podem fornecer uma visão única de como os canais ativados por mecano enviam mudanças em seu ambiente nativo e geram respostas fisiológicas.
