Name: an ex vivo model to study hormone action in the human breast
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
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Os autores agradecem M. Fiche do Hospital Universitário de Lausanne para fornecer a fotografia mamoplastia, M. Wirth e A. Ayyanan do Swiss Institute for Cancer Research Experimental, Centro Nacional de Competência em Pesquisa de Oncologia Molecular, Faculdade de Ciências da Vida, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne para a assistência técnica e R. Clarke, da Universidade de Manchester para comentários críticos. A investigação conducente a estes resultados foi recebido apoio de SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, eo Innovative Medicines Initiative empresa comum ao abrigo do contrato de concessão não. 115.188, recursos de que são compostas de contribuição financeira do Sétimo Programa da União Europeia Quadro (FP7 / 2007-2013) e Federação Europeia das Associações e Indústrias Farmacêuticas empresas »da contribuição em espécie. O endereço Web de Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores é <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Considerações gerais: antes do tempo, o estabelecimento de um protocolo de ética, preparar questionários para os pacientes, e ver a formação do pessoal clínico. Antes de usar o material de cirurgia mamoplastia de redução, obter autorizações, e assegurar o consentimento do paciente. Tecido podem ser infecciosos e precisa de ser tratadas em conformidade. Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do ISREC - Instituto Suíço de Experimental Cancer Research. 1. Tissue Recovery, Processamento e Bio-banking Para garantir a qualidade da amostra ideal para o bio-banking, uma série de passos são realizados no hospital antes do transporte para o laboratório. No hospital: <ol><li> Obter tecidos da mama humanos sob condições estéreis a partir de amostras de cirurgia mamoplastia de redução e de sangue, se necessário. Tissue precisa ser examinado pelo patologista que vai provar para excluir a presença de lesões malignas. </li><li> Coloque o peito de temitir sob o capô em uma placa de estéril e preparar tesoura, bisturi cirúrgico e pinças que já estão esterilizados com esterilizador a vapor. Faça profundo corte em diferentes locais do tecido mamário utilizando um bisturi para abri-lo. Em tecido mamário humano olhar para fios brancos que consistem em dutos e lóbulos, que são incorporados no tecido adiposo amarelo. Observação: A razão entre o parênquima branco para o tecido adiposo amarelo difere entre as mulheres; Normalmente as mulheres mais jovens têm mais tecido epitelial. </li><li> Escolha pedaços de material branco e mantê-los com uma pinça, então separá-los suavemente do tecido adiposo com uma tesoura. Evite tomar vasos sanguíneos. </li><li> Lavar peças de tecido em solução salina fosfato tamponada (PBS) pH 7,2 para remover o sangue. Transferir o tecido para garrafas de plástico de 250 ml contendo meio F12 (F12 Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) sem vermelho de fenol com 2% de penicilina / estreptomicina (incluindo 5.000 unidades / ml de penicilina e 5000 g / ml de estreptomicina) e 1% de umtibiotic / anfotericina B (incluindo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina, e 25 ug / ml de anfotericina B). Armazenar tecidos no meio de transporte para o laboratório. </li><li> Prepare pedaços de 3-5 mm de diâmetro para extração de RNA e proteína e flash congelá-los em cryovials com frio (gelo seco) isopentano. Transferi-los para a caixa de gelo seco durante o transporte para o laboratório. </li><li> Coloque pedaços de 3-5 mm no molde e cobri-lo com uma camada de Optimal temperatura de corte (OCT) e, em seguida, coloque o molde sobre o fundo plano da caixa cheia de isopentano frio. Após congelamento total transferir o molde para a caixa de gelo seco. </li><li> Fix 5 pedaços de 3-5 mm de diâmetro em paraformaldeído (PFA) 4% e mais 5 peças em formaldeído (FA) de 4% em PBS a análise histológica RT mais tarde. Dois diferentes fixadores são recomendados como alguns anticorpos trabalham melhor com um ou o outro dos dois. </li></ol> No laboratório: <ol start="8"><li> Fazercument todas as informações sobre a mamoplastia de redução, data da cirurgia e se as amostras são derivados de esquerda versus mama direita. </li><li> Coloque as amostras congeladas a -80 ° C e transferir os tecidos fixados em cassetes de histologia após 2 horas de fixação. Em seguida, colocá-los tanto em PBS ou etanol a 70%, para O armazenamento / N a 4 ° C. No dia seguinte, transferir as cassetes de histologia para instalações de histologia para inclusão em parafina. </li></ol> 2. Tissue Digestão e Hormone Estimulação <ol><li> Transferem-se as garrafas contendo as amostras de tecido para uma câmara de fluxo laminar numa sala de cultura de células P2. Coloque pedaços de tecido sobre a tábua de cortar estéril (29 x 19 cm). Segure o material com uma pinça e raspar o restante gordura e vasos de distância do parênquima mamário (parte branca) com bisturi. Colocar o material branco em PBS numa placa de cultura de 10 centímetros. </li><li> Depois de retirar o material gorduroso de todas as peças e descartá-los de acordo com a norma de seguranças do laboratório, coloque as partes brancas contendo os tecidos epiteliais de volta na tábua de cortar. Usando bisturis opostas cortar o tecido e corte-a em pedaços de até 2 mm de diâmetro. </li><li> Inserir o material triturado em tubos de tamanho adequado: até 1, 2,5 e 10 ml para um 5, 15 ou tubos de 50 ml, respectivamente. Normalmente de 5 ml rendimentos tubo material suficiente para incrustação de parafina e hormonais estímulos, e de 15 ml produz tubos de material suficiente para fluorescência celular ativado (FACS). Tubos maiores são usados ​​para congelar alíquotas. </li><li> Preparar a mistura mestre digestão consistindo em meio (DMEM / F12 sem vermelho de fenol) com 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B e colagenase A (Clostridiopeptidase A de Clostridium histolyticum). Dose de colagenase de acordo com tempos de digestão. <ol><li> Para 12, 24, e 36 h de incubação, usar concentração final de colagenase de 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml e 0,5 mg / ml, respectivamente. Adicionar mix mestre digestão até 4 vezes davolume do material digerido para assegurar a agitação e o arejamento adequado. NOTA: Dependendo do desenho experimental e a duração da estimulação hormonal, adicionar hormônios durante ou após a etapa de digestão e microestrutura de recuperação enzimática. </li></ol></li><li> Adicionar hormona (s) a uma concentração desejada para testar amostras e o veículo de controlo. Para a estimulação com 17-β-estradiol, e promegestona (R5020) utilizar uma concentração final de 20 nM. NOTA: R5020 é um agonista do receptor de progesterona sintética, que é mais estável do que a progesterona natural em meio. <ol><li> Colocar os tubos sobre o misturador de rolos dentro de uma incubadora a 37 ° C e 40 rpm O / N. Antes de colocar as amostras no misturador, ressuspender-los muito bem para garantir que todo o material distribui ao longo dos tubos de centrífuga. </li></ol></li><li> Como a digestão demora pelo menos 12 horas (O / N), por vezes de estimulação da hormona de menos de 12 horas, adicione os hormônios após a recuperação das microestruturas (deatado na etapa 3). Adicione os hormônios como você voltar a suspender as microestruturas e coloque a suspensão em placas ultra-baixas de fixação. Microestruturas dos tecidos podem ser mantidos em ultra-baixas placas de fixação para até 7 dias em meio de cultura livre de fator de preservação de cerca de 70% de viabilidade. </li><li> Para ARN e análise de proteínas, recolher microestruturas dos tecidos por centrifugação a 400 xg durante 5 min e flash congelamento em tubos de centrífuga. </li></ol> 3. Recuperação de microestruturas de tecidos <ol><li> Centrifuga-se o tubo (s) a 400 xg durante 5 min. Aspirar a gordura a partir do topo do tubo de centrifugação e transferir o sobrenadante do sobrenadante aquoso remanescente, que é enriquecido em fibroblastos, para um novo tubo de centrífuga e centrifuga-se a 1250 xg durante 5 min. NOTA: Como as microestruturas do tecido mamário são muito pegajoso, para todas as etapas subseqüentes colocar o agregado agitando suavemente o tubo. Pipetting não é recomendada devido ao risco de perder o material. </li&gt; <li> Ressuspender as pelotas enriquecidas em microestruturas e em fibroblastos derivados de sobrenadante aquoso em PBS, 2% de Soro Fetal de Vitela (FCS). Subsequentemente girar em ambos os tubos 1250 xg durante 5 min e, em seguida, descartar os sobrenadantes. </li><li> Ressuspender as pelotas em 3-5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e transferi-los para tubos limpos. Incubar-los durante 5 min à TA. </li><li> Adicionar o volume de 2x PBS, 2% de FCS e centrifugar para a 1.250 xg durante 5 min. Lavam-se as peletes com PBS, FCS a 2% e centrifugação a 1250 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes. </li></ol> 4. As amostras de Citometria de Fluxo <ol><li> Adicionar 1-2 ml de tripsina a 0,25% ao sedimento e misture por pipetagem cima e para baixo com muito cuidado para 2 min com um Pipetman 1.000 ul dissociar células. </li><li> Inibir a actividade da tripsina por adição de 9 ml de PBS, 2% de FCS. Centrifuga-se a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS, 2% de FCS. </li><li> Transferir a suspensão de células para um filtro de células de 40 mm colocada sobre top de um tubo de centrífuga de 50 ml para preparar células individuais. Se alguns microlitros de suspensão de células permanecem na parte superior do filtro, ajudá-los a passar através do filtro por aspiração los a partir do outro lado do filtro com uma pipeta e adicioná-los para as microestruturas filtrados. </li><li> Anticorpos células imunitárias separadas, fibroblastos e células endoteliais a partir de microestruturas com um cocktail de anticorpos anti-CD45, anti-PAF e anti-CD31 e depois separá-los com FACS, com base em pan-epitelial EpCAM marcador CD10 e para separar as células luminais e basais, respectivamente, 10 . </li></ol> 5. As amostras para histologia <ol><li> Depois de se lavar o material mecanicamente e enzimaticamente digerido como descrito acima, a partir de peletes de fixar o material inicial de 1,5 ml em 1 ml de 4% de PFA em PBS à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 1.250 xg durante 5 minutos e lava-se com 1 - 2 ml de PBS, duas vezes. </li><li> Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min. Durante este tempo, preparar 1% multiusos de agarose em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) de tampão e aquecer a solução no forno de microondas até a solução começar a ferver. <ol><li> Remover a solução do forno microondas e agite o frasco suavemente para misturar a solução e voltar a suspender qualquer restantes partículas de agarose. Arrefecer a solução de agarose a 50 ° C e deitar 1 ml num molde da base de parafina dimensionada 31 × 23 × 13,5 milímetros. </li></ol></li><li> Descartar o sobrenadante e colocar os sedimentos em cima da camada solidificada (1-3 mm) de agarose utilizando uma espátula com uma extremidade plana. Cobrir todas elas com uma camada adicional de agarose (40 ° C). </li><li> Após os solidifica de agarose, geralmente dentro de 5 min, colocar os blocos de agarose para as cassetes de histologia para parafina embedment. Junto com as amostras de agarose colocar um papel branco de escritório na cassete com todas as informações sobre o número de mamoplastia redutora, a condição experimental, e data escrita em letras pequenas a lápis; este documento foi escrito resiste todas as etapas de tratamento subsequentes. </li><li> Coloque as cassetes emPBS S / N, ou em etanol a 70% para armazenamento no fim de semana, a 4 ° C. Nós não notei nenhuma diferença entre as duas soluções de armazenamento. Em seguida, transferir cassetes histologia às instalações de histologia para inclusão em parafina. </li></ol> 6. As microestruturas congelamento (Futuro) Cultivar <ol><li> Ressuspender as microestruturas de tecidos em meio consistindo em FCS com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e congelar em alíquotas de 1 ml criotubos congelação. O número de criotubos obtidas depende da quantidade de matéria-prima obtida a partir de mamoplastia de redução. </li><li> Congelar as criotubos contendo microestruturas dos tecidos utilizando um congelador de taxa controlada com o seguinte programa: 5 minutos a 4 ° habitação C, diminuindo a temperatura de -7 ° C com uma taxa de 6 ° C / min, diminuindo a temperatura a -12 ° C com taxa de 6 ° C / min, 10 min habitação, diminuindo a temperatura a -40 ° C com uma taxa de 6 ° C / min, a diminuição na temperatura de -80 ° C comtaxa de 6 ° C / min. Em seguida, transfira os cryovials a -80 ° C congelador. </li><li> No dia seguinte, a transferência dos criotubos de -80 ° C para o tanque de azoto líquido durante muito tempo de armazenagem. </li></ol>

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C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+the+FACS:+a+devil+in+the+details.">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A cultura ex vivo descrito aqui fornece microestruturas dos tecidos mamários contendo ductos e lóbulos intactos, juntamente com outros tipos de células encontradas normalmente no peito fêmea humana. No processamento do tecido da mama humana obtidos geralmente de mamoplastias de redução, a remoção de tecido adiposo, a digestão enzimática e mecânica da matriz estromal, e a lise de células vermelhas do sangue enriquece para fragmentos de condutas de leite e unidades lobulares ductais terminais. Digest?...

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informações sobre a paisagem mutacional no câncer de mama está aumentando em ritmo acelerado. Menos atenção tem sido dada a fatores sistêmicos que influenciam o desenvolvimento do câncer de mama. A exposição a hormônios reprodutivos tem um grande impacto na progressão da doença 1-3. No entanto, os mecanismos pelos quais as hormonas reprodutivas embatem na mama humano são mal compreendidos. Trabalho com modelos de engenharia genética do rato revelou que envolvem células sinalização intrínseca e paracrine por vários efectores a jusante 4. O conhecimento limitado sobre ação do hormônio no peito humano é largamente atribuível à falta de modelos adequados. A maioria dos trabalhos sobre os mecanismos de receptor de estrogénio (ER) e o receptor de progesterona (PR), a sinalização tem sido realizada com linhas de células positivas do receptor de hormona, cancro da mama, tais como MCF-7 e T47D. Estes foram obtidos a partir de derrame pleural de pacientes com câncer de mama avançado que tinha already recebeu vários tratamentos 5. A importância biológica dos resultados obtidos em tais modelos in vitro simples da mama humano é genes questionáveis ​​e alvo identificados nestes modelos in vitro são diferem dos genes-alvo que são identificados em modelos animais 6. Quando as células epiteliais mamárias humanas primárias são cultivadas in vitro tendem a perder a expressão de receptores hormonais e, portanto, resposta hormonal 7,8. Este problema pode ser circumventd por abordagens 3D sofisticados usando matrigel. Desta forma, C. Clarke e colegas conseguiram estabelecer as células epiteliais da mama que mantiveram a expressão do receptor da hormona e que demonstraram uma resposta proliferativa para a estimulação da progesterona 9. No entanto, importante em dois genes alvo in vivo do receptor da progesterona, Wnt-4 e RANKL, não foram induzidas por estimulação da progesterona no presente sistema 9. Esta abordagem foi tomada recentemente em mais longe com in vitro </em&gt; pré-tratamento hormonal e indução RANKL foi alcançado 10. A ressalva é que matrigel tem atividades que são dependentes do lote, é caro, e exige um projeto experimental que está apto apenas para o número de células pequenas. Com base na descoberta de que em ER vivo e sinalização PR são largamente mediada por interacções parácrinos 11, que argumentaram que as interacções intercelulares precisam de ser mantidas. Outro factor importante que é perdida como tecidos estão dissociados para células únicas para a cultura in vitro são as interacções de células epiteliais com a matriz extracelular; No entanto, estes são fundamentais para diferenciação epitelial e sua perturbação é importante na tumorigênese 12. Com isto em mente, nós estabelecemos um método para isolar microestruturas tecido mamário a partir de material de descarte cirúrgico fresco 13. O parênquima da mama, que consiste de um epitélio de duas camadas com o interior do lúmen e exterior myoepithelicélulas al, é dissecado a partir de tecido adiposo e submetido a dissociação mecânica e enzimática. Após a lavagem e centrifugação, fragmentos de dutos de leite são obtidos que manter interações estreitas com muitas células estromais. Estes micro-estruturas dos tecidos permanecem hormônio responsivo. O modelo foi validado em amostras clínicas 13. Como tal, o presente processo pode ajudar a estudar a acção de hormonas na mama num contexto biológico e clinicamente relevante.

<table><tbody><tr><td>Microlitre Centrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td><td>Asymptote&amp;nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histology Cassettes</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Surgical Blade&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin base mold</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials (5.0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment culture dish</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

O estudo da ação do hormônio no peito humano tem sido dificultada pela falta de sistemas de modelos adequados. Após a cultura in vitro, células epiteliais mamárias primários tendem a perder a expressão de receptores hormonais. Amplamente receptores hormonais linhas celulares de cancro da mama positivo utilizados são de limitada relevância para a situação in vivo. Aqui, descrevemos um modelo ex vivo para estudar a ação hormonal no peito humano. Amostras frescas de tecido da mama humano a partir de material de descarte cirúrgico, tais como mamoplastias de redução ou mammectomies são mecanicamente e enzimaticamente digerido para obter fragmentos de tecido contendo ductos e lóbulos e vários tipos de células do estroma. Estes micro-estruturas dos tecidos conservados em meio basal sem fatores de crescimento preservar seus contatos intercelulares, a arquitetura do tecido, e permanecem hormônio que responde por vários dias. Eles são processados ​​prontamente para RNA e extração de proteínas, análise histológica ou armazenados em meio de congelamento. Fluorescênciaseparação de células activadas (FACS) pode ser usado para o enriquecimento em populações de células específicas. Este protocolo fornece uma abordagem simples, padrão para estudos translacionais com alta complexidade, amostras humanas variadas.

Para estudar o papel dos estrogênios e progesterona e compreender melhor suas funções moleculares no peito humano, coletamos amostras de tecido fresco de mama humano de pacientes submetidos a mamoplastias de redução (Figura 1), após aprovação do consentimento informado. Nós também obter história médica e reprodutiva do paciente, bem como uma amostra de sangue para determinar os níveis de progesterona no soro no momento da cirurgia. Tecido de mamoplastias de redução frescos é mecanicament...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K visualizações.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina. 

Vídeo: An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Pesquisa do câncer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Bioengenharia

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Medicina

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo resposta ao tratamento de tumores primários e / ou Associated Metástases para pré-clínica e clínica de Desenvolvimento Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Um

Resumo

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