Gostaríamos de agradecer ao Dr. Hesham Abdelbary humana para a prestação de espécimes cirúrgicos para os dados apresentados na Figura 2.

1. Processamento de tecidos <ol><li> Para melhores resultados, este protocolo deve ser realizado com recém-tecido isolado depositados em media DMEM contendo 10% FBS, 1% de solução Pennicilin / estreptomicina e 0,1% Anfotericina B solução imediatamente após a cirurgia antes do processamento. Se isso não for possível, os tecidos podem ser deixados durante a noite neste meio a 4 graus antes do processamento. </li><li> Antes do processamento da amostra, esterilizar pinças de metal e lâminas descartáveis, colocando-os em uma solução de etanol 70% por pelo menos 5 minutos. Também preparar uma placa de 24 poços com 2 ml de DMEM mídia contendo 10% FBS, 1% de solução Pennicilin / estreptomicina e 0,1% Anfotericina B. </li><li> Coletar a amostra de tecido em um fluxo laminar de cultura de células usando uma pinça esterilizada e depositar o tecido em um prato de 15 centímetros vazio petri, mantendo a tampa ao lado, o lado estéril para cima. </li><li> Na capa de cultura de células, use de 2 mm biópsia com punch de obter diferentes cores de uma variedade de regiões dentro do tecido como na Figura 1. Depósito dos núcleos na tampa do petri de 15 cm com a ajuda de uma pinça, deixando espaço suficiente entre cada núcleo, para que possam ser facilmente cortados ao longo do eixo horizontal. </li><li> Dividir cada núcleo em 4 / 4, mesmo usando uma lâmina de barbear esterilizados, conforme a Figura 1. </li><li> Usando a ponta da pipeta, coloque cada trimestre do núcleo de um núcleo em um dado bem diferente de A1 a A4 como na figura 1, já contendo 1,5 ml de DMEM contendo 10% FBS, 1% de solução Pennicilin / estreptomicina e 0,1% Anfotericina solução B . Repita o procedimento para cada núcleo. Isso deve permitir uma amostragem representativa do tumor, minimizando viés de um bem dado / condição. Para uma melhor representação, aumentar o número de núcleos. </li></ol> 2. Avaliação da viabilidade tecidual <ol><li> Processamento de tecidos seguir, adicione 25μl Alamar blue para o bem # A1 e A2 #, como mostrado na figura 1 e incubar por 1 hora a 37 graus em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2. </li><li> Após a incubação com alamar azul, remova 3 vezes 100 l de cada A1 e A2 bem e transferir a 6 diferentes poços de uma placa de 96 poços. Ler o sinal através de um leitor de placas de fluorescência (excitação 530, 590 emissões) e manter os dados em seus registros. </li><li> Depois de Alamar sinal azul foi lido, a transferência de todas as peças de tecido usando uma ponta da pipeta, de bem A1 a C1 que contém DMEM, FBS 10% + PS + AmphoB. Tenha cuidado para não transferir uma quantidade excessiva de meios de comunicação de bem A1. </li><li> Infectar poços A3 e A4, respectivamente com 10 PFU 6 de GFP-luciferase expressar e expressar-vírus vaccinia diluída em 25 mL de mídia. Bem A2 pode ser infectado com um vírus que que expressa qualquer transgene dada incluindo nenhum. </li><li> 72 horas depois, adicionar 25 mL Alamar blue aos poços C1 e D1 e repita o passo 2,2 </li></ol> 3. Visualização de GFP expressão do transgene por microscopia de fluorescência <ol><li> Remova toda a mídia de cultura de células que cobrem os pedaços de tecido a fim de ter bom imagens de fluorescência. </li><li> Usando um microscópio de fluorescência dissecção com capacidade, primeiro dar uma imagem de contraste de fase em uma resolução apropriada </li><li> Alternar para o modo de fluorescência e tirar uma foto usando o filtro apropriado para visualizar o transgene de interesse, neste caso GFP. </li><li> Use um filtro de fluorescência para outro comprimento de onda até um possível daquela do transgene de interesse (como RFP) para tirar uma foto de fluorescência de fundo </li></ol> 4. Visualização de expressão usando um luciferase In Vivo Imaging System (IVIS) <ol><li> Certifique-se que o IVIS é inicializado antes de começar. </li><li> Em poços A4 e B4, adicionar 5 mL de substrato luciferina 10 mg / ml, misture bem e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Definir o tempo de exposição IVIS a 5 segundos e tirar uma foto de seus poços. Se a imagem está saturado, repetir com menor tempo de exposição. Se não houver nenhum sinal, aumentar o tempo de exposição. </li><li> Usando o software de imagem IVIS, você pode remover fundo usando o sinal de bem B4 e selecione a região de interesse para quantificar o sinal de luminescência. </li></ol> 5. Avaliar os títulos viral através do teste de placa <ol><li> Antes de quantificação viral títulos, os tecidos devem primeiro ser homogeneizadas para liberar partículas virais. Isto pode ser feito alguns meses mais tarde nas amostras de tecidos infectados são armazenadas a -80 </li><li> Pesar a amostra que deve ser homogeneizada utilizando uma balança analítica. Neste caso, vamos usar a amostra coletada a partir de A2 bem. </li><li> Coloque o tecido está em 5 ml de poliestireno de fundo redondo de tubo falcon e adicionar 1 ml de PBS. Homogeneizar o tecido usando um homogeneizador de tecidos. Se necessário, armazenar a -80 o homogeneizado para avaliação dos títulos viral em um momento posterior. </li><li> A titulação do vírus vaccinia, primeira placa 1 milhão de células em um prato U2OS 6-bem e incubar durante a noite em um grau 37, 5% de CO 2 úmidoified incubadora de tal forma que eles tenham atingido cerca de 95% a confluência dia seguinte. </li><li> Use soro de mídia livre para fazer diluições seriadas do vírus, certificando-se de mudar dicas entre cada etapa de diluição. Normalmente fazemos uma em 10 diluições e uso 100 l para transferir para 900 mL. Quantas diluições são feitas depende do rendimento de vírus previsto. </li><li> Após fazer as diluições, remova a mídia que cobre as células U20S banhado em seguida, adicione 500 mL de estoque vírus diluído (para cada diluição) para infectar as células U2OS. Incubar as células de um minuto hora a 37 graus Celsius em 5% incubadora de CO 2 umidificado. </li><li> Durante esse tempo, aquecer o X 2 concentrada DMEM contendo 20% FBS, ea solução a 3% CMC em banho-maria 37 graus. </li><li> Após a incubação de 1 hora, retire os meios de comunicação que cobrem as células infectadas U2OS. Mix 01:01 volumes de 3% CMC: 2X DMEM, 20% FBS juntos e usar 2 ml desta mistura para cobrir cada poço das células infectadas U2OS. </li><li> Coloque as células de volta em um 37 graus 5% incubadora de CO 2 umidificado por mais 48 horas. </li><li> Após 48 horas, adicionar 2 ml de metanol-ácido acético fixador em cima da sobreposição CMC em cada poço e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos em uma capa de cultura de células. </li><li> Descartar a sobreposição fixa e lavar restante fora dos poços com água da torneira. </li><li> Mancha as células fixas U2OS com 2 ml de solução de azul de Coomassie por poço e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente em baixa velocidade em uma placa de shaker. </li><li> Remova a mancha coomassie dos poços e lavar os pratos com água da torneira. Deixe secar com tampa off por aproximadamente uma hora. </li><li> As placas resultante viral pode ser facilmente visualizado na figura 2C. As placas podem ser armazenadas indefinidamente nesta fase. </li><li> Contagem de placas na etapa de diluição, onde entre 10 e 100 placas são visíveis. </li><li> Multiplicar o número de placas contados pela diluição usada e multiplicar o número resultante por 2 a dar um título em PFU / ml. Por exemplo, se 25 placas são contados no poço onde uma diluição milhão de vezes foi utilizado, a título de amostra inicial não diluída é de 25 multiplicado por um milhão multiplicado por 2 ou 50 milhões de PFU / ml. Dividir ainda mais este número pelo peso inicialmente medida para a amostra de relatório títulos em UFP / g </li></ol> 6. Resultados representativos: , A fim de determinar com precisão se uma amostra de tecido obtidas cirurgicamente normal / tumor é ou não é infectáveis ​​com o vírus, é preciso primeiro garantir que a amostra de tecido é pelo menos viável. Fig. 1A mostra que a viabilidade pode ser avaliada utilizando um corante metabólica (Alamar blue) e que o tecido normal e tumor pode permanecer metabolicamente ativas durante um período de pelo menos 72h. Isto sugere que os tecidos ex vivo de cultura pode suportar a replicação viral. Uma vantagem significativa de vírus oncolytic é que eles podem ser projetados para expressar transgenes terapêuticos ou de imagem. Fig. 2D-E mostra que a GFP ou luciferase podem ser detectados a partir de tecidos infectados ex vivo, um maior apoio que esses tecidos são viáveis ​​e também infectáveis. Embora a expressão do transgene aumento é geralmente associado com a replicação viral, não necessariamente equivale a um ciclo de vida produtiva viral que leva à auto-ampliação e disseminação, o que é pensado para ser importante para a atividade terapêutica. Por esta razão, é necessário determinar se mais vírus é produzido do que o que inicialmente foi usada para infectar o tecido. Fig. 2B mostra que após a quantificação viral pelo ensaio de placa, mais vírus é obtida após 72 horas depois da infecção dos tecidos coletados imediatamente após a infecção. Em geral, estes dados mostram que o tecido do tumor extirpado cirurgicamente podem permanecer viáveis ​​em cultura de células por um período de pelo menos 72 horas, durante o qual a replicação viral tempo pode ser suportada. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Visão geral do tecido amostragem / secção de protocolo. Amostra de tecido é processado através da remoção de vários núcleos de 2 mm, que são posteriormente divididos em quatro quartos, que são distribuídos aleatoriamente em poços A1-A4. Os códigos de cores indicam os reagentes utilizados em cada poço. Os quadrados cinza sombreado dentro dos poços representam cada trimestre a partir da 6 núcleos individuais descritos. O tecido em bem A1 é transferido para um novo poço (C1) com a mídia após a leitura inicial alamar azul. A segunda leitura é feita no final da incubação de 72 horas com vírus. Wells A4 e B4 são complementados com Luciferina após a incubação 72 horas pós-infecção <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Viabilidade e infectability de amostras de tecido do paciente. A) a viabilidade do tecido medida pelo alamar sinal azul em 2 horas e 72 horas após a coleta. Eixo Y representa o espaço em branco corrigido alamar sinal azul. B) título de vaccinia viruscoletados por grama de amostras de tecido 2 e 72 horas pós-infecção C). Exemplo de placas vírus vaccinia nas células U2OS seguintes coomassie coloração. D) do sinal de luminescência obtidos a partir de tecido VV-luciferase pacientes infectados fotografada usando IVIS. E) imagens de microscopia de fluorescência de amostra de tecido do paciente infectado com VV-GFP.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III/IV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck.">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li><li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reovirus:+Rationale+and+clinical+trial+update.">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li><li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer.">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , (2010).</li><li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses.">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li><li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers.">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , (2010).</li><li>Kuip, H. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um dos passos críticos neste protocolo é a obtenção de amostra de tecido fresco. Se a amostra é colocada em cultura de células após uma longa espera na sala de operação em um meio inadequado (por exemplo PBS), isso pode comprometer a viabilidade do tecido e evitar infectability. De nota, o tecido normal é inerentemente mais propensa a estes efeitos que os tecidos do tumor. Outro ponto crítico é quantos núcleos são usados ​​para amostra do tecido e da coerência de seu tamanho. Inconsistências no tamanho levará a variabilidade entre as amostras do paciente já que fatores como hipóxia tecidual e superfície infectectable irá flutuar, dependendo do tamanho dos núcleos e bairros centrais. Embora isso possa ser parcialmente resolvido usando cortadores de tecido, uma vantagem do método apresentado aqui é que é relativamente fácil, menos propenso à contaminação, e amplamente aplicável a uma variedade de tipos de tecidos, incluindo tecidos moles ou viscoso que não são facilmente passíveis corte para o tecido. Nomeadamente, o número de núcleos pode ser aumentada a fim de obter uma melhor representação dos tecidos. Além disso, os núcleos podem ser cortados em pedaços mais (ex. 5-8) para acomodar outros ensaios potencial para ser feito em paralelo, tais como DNA, RNA, ou extração de proteínas. No entanto, o número de peças em que os núcleos podem ser cortadas em tamanhos reprodutíveis vai depender do tamanho real dos núcleos, que podem ser modificados usando diferentes corers porte. Opcionalmente, uma forma de ajudar a obter pedaços de tecido reproducibly tamanho é igualar o comprimento dos núcleos usando uma régua antes subdividindo-os em pedaços menores. O protocolo pode naturalmente ser modificado para acomodar outros vírus e nós descobrimos que os tecidos podem ser viáveis ​​e suporte a replicação para até 6 dias. O protocolo pode ainda ser estendida a outras medidas de virally-expressa transgenes incluindo cytrokines. Após a infecção, os tecidos também podem ser incluídos em parafina para posterior corte e coloração pelos métodos de imuno-histoquímica, que permite o aperfeiçoamento da histologia do tecido e como se relaciona a uma infecção viral 10-12.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM alta glicose </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> NorthBio Inc. </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Anfotericina solução B </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Use a 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin Estreptomicina- </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Use a 1% </td></tr><tr><td> Alamar Azul </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferina sal de potássio </td><td> Molecular Imaging Products </td><td> D-sal de potássio Luciferina 1g </td><td> Ressuspender em PBS a 10 mg / ml e filtrar em filtro de 0,22 mM </td></tr><tr><td> MEM pó </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Fazer na metade do volume sugeriu fazer MEM 2X e filtrar em filtro de 0,22 mM antes do uso </td></tr><tr><td> Carboximetil celulose (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Fazer uma solução de 3% em água deionizada e autoclave. Note-se que o pó pode levar algum tempo para voltar a suspender </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 milímetros biópsia com punch </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Blades Prep Double Edge </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência dissecção </td><td> Leica </td><td> modelo M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> In vivo de imagens do sistema (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® série 200 </td><td></td></tr><tr><td> Tearor tecido </td><td> Produtos Biospec </td><td> modelo 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

Vírus Oncolíticos (OVS) são novas terapêuticas que, seletivamente, replicar e matar as células tumorais 1. Vários ensaios clínicos avaliando a eficácia de uma variedade de plataformas, incluindo oncolytic HSV, reovírus e OVS Vaccinia como tratamento de câncer estão atualmente em andamento 2-5. Uma característica chave do vírus oncolytic é que eles podem ser geneticamente modificados para expressar transgenes repórter que torna possível visualizar a infecção dos tecidos por microscopia ou bio-luminescência de imagens 6,7. Isto oferece uma vantagem única vez que é possível infectar os tecidos de pacientes ex vivo antes da terapia, a fim de verificar a probabilidade de sucesso virotherapy oncolytic 8. Para este fim, é fundamental para adequada amostra de tecido para compensar a heterogeneidade do tecido e avaliar a viabilidade do tecido, particularmente antes da infecção 9. Também é importante seguir a replicação viral utilizando transgenes repórter se expressa pela plataforma oncolytic, bem como por titulação direta de tecidos após a homogeneização, a fim de discriminar entre infecção abortiva e produtivo. O objeto deste protocolo é para abordar estas questões e aqui descreve um. A amostragem ea preparação do tecido tumoral para cultura de células 2. A avaliação da viabilidade tecidual utilizando o corante alamar blue metabólica 3. Infecção ex vivo de tecidos cultivados com o vírus vaccinia expressando GFP ou seja firefly luciferase 4. Detecção da expressão do transgene por microscopia de fluorescência ou usando um In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantificação do vírus por ensaios de placa. Este método abrangente apresenta várias vantagens, incluindo a facilidade de processamento de tecidos, a compensação para heterogeneidade de tecidos, o controle da viabilidade tecidual, ea discriminação entre a infecção abortiva e replicação viral fide osso.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolíticos vírus são promissores para o câncer de terapêutica. A capacidade de determinar a infectability de amostras de tecido vivo obtidos de pacientes antes do tratamento é uma vantagem exclusiva dessa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve como processo de tecidos para<em&gt; Ex vivo</em&gt; Infecção com o vírus oncolytic e quantificação viral subseqüente.

Ex Infecção Vivo de tecido vivo com Vírus Oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K visualizações.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). Oncolíticos vírus são promissores para o câncer de terapêutica. A capacidade de determinar a infectability de amostras de tecido vivo obtidos de pacientes antes do tratamento é uma vantagem exclusiva dessa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve como processo de tecidos para Ex vivo Infecção com o vírus oncolytic e quantificação viral subseqüente.

Vídeo: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Cultura Vivo de tecido do paciente e Exame de Entrega Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Medicina

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...