O microbioma intestinal desempenha papéis importantes na formação da fisiologia do hospedeiro. Este protocolo, em particular, permite a avaliação de alto rendimento dos níveis de colonização por micróbios intestinais fluorescentes em animais celulares únicos em larga escala. Um grande benefício desse método é a capacidade de monitorar o microbioma intestinal de animais vivos em tempo real, o que permite a identificação e correlação de quaisquer alterações com a fisiologia do hospedeiro.
Quem demonstrará o procedimento será Dana Blackburn, pesquisadora associada do meu laboratório. Comece lavando os vermes do gramado bacteriano com um a dois mililitros de M9-TX. Transfira os vermes para uma placa esterilizada de dois mililitros 96 bem profunda.
Pelotá-los a 300 G por um minuto e remover o líquido usando um coletor de aspiração. Usando uma pipeta multicanal de 1,2 mililitros, adicione 1,8 mililitros de M9-TX a cada poço da placa do poço profundo misturado por pipetagem algumas vezes e centrifugação a 300 G por um minuto. Após a lavagem final, leve o volume em cada poço para 100 microlitros, utilizando o coletor aspirador.
Adicione 100 microlitros de levamisol de 10 milimolares e M9-T a cada poço e deixe os vermes paralisarem por cinco minutos. Em seguida, adicione solução de água sanitária a 4% em cada poço por dois minutos para reduzir os aglomerados bacterianos. Após o tratamento com água sanitária, adicione M9-TX em cada poço da placa para lavar as minhocas.
Centrifugar a placa e aspirar até um volume final de 100 microlitros após a segunda lavagem. Transfira os vermes para uma placa de fundo plano de 96 poços, contendo 150 microlitros de 10 milimoles de levamisol e M9-TX. Mantenha a densidade de vermes em 50 a 100 vermes por poço e divida os vermes em vários poços se a população estiver muito lotada.
Ligue o compressor de ar, o computador e o instrumento LPS. Verifique e esvazie o tanque de resíduos. Verifique e reabasteça bainha e caixas d'água se o volume estiver baixo.
Verifique se o conjunto de núcleo fluídico e óptico de 250 micrômetros está no lugar. Conecte e ative o amostrador automático. Abra o software do instrumento do amostrador automático para abrir o amostrador automático e o software LPS.
Na janela do software LPS, vá para o arquivo e clique em novo experimento, selecione o arquivo novamente e clique em nova verificação de amostra. Permita que os lasers liguem lasers de 488 e 561 nanômetros, se isso ainda não tiver sido feito. Agora crie modelos para gráficos de pontos de aquisição, usando tempo de voo, extinção e canais fluorescentes na janela do software LPS.
Clique com o botão direito do mouse no corpo de um gráfico para modificar o dimensionamento. Em seguida, carregue as amostras de controle. Na janela do amostrador automático, selecione prime, vá para o arquivo, clique em abrir script para selecionar o script interno correto e clique em OK.
Vá para o modelo de placa no menu do software amostrador para selecionar os poços desejados para análise. Depois de carregar e fixar a placa no estágio do amostrador automático, pressione a placa de execução na janela do amostrador automático e salve o arquivo quando solicitado, clique no botão armazenar dados atuais na faixa de opções superior na janela do software LPS e salve os dados novamente. Abra o software LPS.
Navegue até o arquivo e selecione novo experimento, depois volte para o arquivo e clique em novo exemplo. Crie um gráfico de pontos com o tempo de voo no eixo X e extinção no eixo Y. Crie outro gráfico de pontos com o tempo de voo no eixo X e vermelho no eixo Y.
Certifique-se de verificar se os lasers ativam os lasers de 488 e 561 nanômetros. Posicione o tubo de amostra de controle na porta de amostra e, em seguida, clique em adquirir dentro da caixa de diálogo adquirir e dispensar. Quando solicitado, certifique-se de salvar o arquivo.
Uma vez que vermes suficientes tenham sido medidos para diferenciar populações, selecione abortar no gráfico de pontos mostrando o tempo de voo versus extinção. Desenhe um portão ao redor da área representando a população adulta. Em seguida, navegue até a exibição, clique em hierarquia de limite e verifique se os portões fluorescentes estão listados corretamente sob o portão da população adulta.
No tempo de voo versus gráfico de pontos vermelhos, crie portões ao redor das áreas de alto e baixo valor vermelho para destacar as regiões de interesse que mostram a colonização do microbioma em vermes adultos. Depois que as configurações forem otimizadas, vá para o arquivo e clique em salvar experimento, clique em arquivo e selecione salvar amostra. Para carregar o aparelho de coleta, selecione a placa de carga A para permitir que a etapa de coleta se mova para uma posição preparada para carregar um tubo de coleta ou uma placa de 96 poços.
Para dispensar uma placa de 96 poços, vá para a seção de configuração e selecione as placas, depois clique em placas calibradas e escolha a placa de 96 poços. Em seguida, selecione os poços para os quais os vermes serão classificados e insira o número de objetos a serem classificados em cada poço. Certifique-se de especificar as regiões fechadas de interesse também.
Se houver várias regiões fechadas sendo classificadas na mesma placa, certifique-se de marcar a caixa marcada portão cada poço. Clique em OK para salvar as alterações. Depois de classificar os números e atribuir os locais, carregue a amostra na porta de amostra e clique nos botões da placa de enchimento da caixa de diálogo de aquisição e distribuição para iniciar a distribuição em uma placa de 96 poços.
Maiores valores de extensão e tempo de voo são observados em adultos em comparação com larvas. Progênies de adultos de dois dias de idade foram dominadas pelos estágios L1 e L2, enquanto a maioria das progênies de adultos de três dias de idade atingiu os estágios L3 e L4. Quando cultivada em E.coli, os valores de tempo de voo e extensão aumentaram no terceiro dia em comparação com o segundo dia.
Quando cultivados em ochrobactrum, BH três e culturas mistas, cenor abdidas allegands mostrou diferenças nos valores de tempo de voo e extensão. Maior colonização pelo ochrobactrum BH3 foi observada na condição mista do que no ochrobactrum BH3 isoladamente. Em contraste, os valores de verde fluorescente indicaram menor colonização OP50 na condição mista do que na OP50 isoladamente.
Os vermes são fortemente inclinados em direção ao eixo Y, sugerindo que a colonização por OP50 é baixa na maioria dos vermes, enquanto os níveis de colonização por ochrobactrum, BH3 estão uniformemente distribuídos na população. A relação entre o ocrobactrum, os níveis de colonização BH3 e o desenvolvimento do hospedeiro, como densidade corporal e as diferenças nos padrões de reprodução, também foi observada. Os adultos de três dias de idade cultivados na mistura de dois membros, microbioma exibiram uma ampla gama de intensidade de RFP, indicando variações individuais na colonização de ochrobactrum dentro do grupo.
Imagens de RFP dos poços contendo 15 vermes classificados e individuais de portas RFP altas e baixas são mostradas. O mais importante é lembrar de usar controles apropriados para todas as etapas para garantir que o protocolo e a máquina estejam funcionando corretamente. Em tempo real, animais com características específicas podem ser usados para isolar cepas de pools de hospedeiros ou mutantes microbianos para identificar genes que regulam interações pós-micróbios.
Animais isolados também podem ser usados para análises fenotípicas baseadas em pool único ou enriquecido a jusante, como RNA-seq ou similares. Realmente, as oportunidades são realmente infinitas.
