O complexo sinaptonemal é um componente chave para a meiose. Para estudar sua função, também devemos entender sua estrutura para a qual a microscopia de super resolução se mostrou incrivelmente útil. Otimizamos nosso protocolo para anexar de forma estável a gônada de C.elegans imunocorada a uma lâmina de cobertura que ajuda a melhorar a resolução até 30 nanômetros em tecidos intactos.
O projeto de experimentos de microscopia de localização de molécula única, a análise subsequente e também a interpretação dos dados podem ser bastante desafiadores e devem ser melhor configurados em conjunto com um especialista. Demonstrando o procedimento estará Ivana Cavka, uma bolsista de pré-doutorado no laboratório. A aquisição das imagens de microscopia de localização de molécula única também será mostrada por Rory Power, engenheiro óptico do MBL Imaging Center.
Comece colhendo vermes Caenorhabditis elegans compatíveis com a idade de placas de ágar NGM. Transfira os vermes para uma gota de 30 microlitros de EBTT em uma folha de cobertura. Lave os vermes com mais 30 microlitros de EBTT.
Remova 30 microlitros da solução deixando uma gota de 30 microlitros com os vermes na tampa. Use uma lâmina de bisturi para cortar as cabeças dos vermes e / ou as caudas para extrudar a gônada. Em uma dissecção bem-sucedida, o tecido das gônadas será totalmente extrudado fora do corpo do verme.
Pipetar 30 microlitros da solução fixadora para a gota dos vermes dissecados. Misture por pipetagem e deixe as amostras fixarem durante um minuto. Pare a fixação exatamente após um minuto, transferindo os vermes usando uma pipeta de 20 microlitros para um tubo de PCR cheio de TBST.
Em seguida, faça uma lavagem girando as amostras dissecadas em uma mini centrífuga de bancada. Uma vez que o sobrenadante é removido, ressuscite os vermes em 200 microlitros de TBST fresco. Após a lavagem final, ressuspenda os vermes em 200 microlitros de PBST e coloque o tubo de PCR no gelo.
Gire as amostras dissecadas em uma mini centrífuga de bancada e remova o sobrenadante. Adicione 50 a 100 microlitros de metanol frio, misture por pipetagem e deixe as amostras em metanol por 30 a 60 segundos no gelo. Lave as amostras duas vezes com 200 microlitros de PBST.
Depois de fiar as amostras e remover o sobrenadante, adicionar a solução de bloqueio às amostras e mantê-la à temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos. Diluir os anticorpos primários para as soluções de trabalho no tampão de bloqueio. Gire as amostras em uma mini centrífuga de bancada, removendo a solução de bloqueio, e adicione 30 a 50 microlitros da solução de anticorpos primários.
Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No final da incubação, lavar as amostras três vezes em PBST. Dilua os dois fragmentos do Fab prime rotulados para as soluções de trabalho no buffer de bloqueio.
Após a terceira lavagem, gire as amostras para baixo, remova o sobrenadante e adicione 30 a 50 microlitros da solução de anticorpos secundários. Colocar a amostra numa câmara escura e incubar durante 30 minutos a duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as amostras três vezes com PBST por cinco a 15 minutos.
Gire as amostras coradas e remova o sobrenadante. Adicione 50 microlitros de PBST e transfira os vermes manchados para uma tampa. Pipetar 5,7 a 6,3 microlitros da solução pós-fixadora para uma tampa de poli-l-licino.
Pipetar os vermes dissecados no mesmo volume e transferir para a gota de fixador na tampa de poli-l-lisina. Cubra a amostra com uma pequena folha de cobertura. Remova o excesso de líquido usando um pequeno pedaço de papel de filtro e fixe a amostra por três a cinco minutos em uma câmara escura.
Congele as amostras colocando-as em um bloco de alumínio em gelo seco. Após pelo menos 20 minutos, remova a tampa menor usando uma navalha. Mergulhe a tampa em um tubo cônico de 50 mililitros contendo PBS gelado ou metanol resfriado a menos 20 graus Celsius por aproximadamente 10 segundos.
Coloque a tampa em um poço de uma placa de seis poços preenchida com buffer PBST. Retire o PBST do poço, adicione o PBST fresco e deixe a amostra por cinco minutos. Após a lavagem com PBST mais uma vez, deixe as amostras a quatro graus Celsius até a imagem.
Antes da imagem, avalie a qualidade da montagem da amostra sob um microscópio estéreo. Se estiver usando o suporte de amostra personalizado mostrado aqui, envolva o anel magnético com parafilme e, em seguida, prepare um mililitro de buffer de imagem. Pegue uma tampa da placa de seis poços.
Coloque-o no suporte personalizado e fixe a tampa no suporte com o anel magnético embrulhado em parafilme. Pipete suavemente o tampão de imagem na câmara criada pelo anel magnético no topo da amostra e sele a câmara usando parafilme. Para montar a amostra, adicione uma gota de óleo de imersão à objetiva de óleo limpo.
Sem introduzir qualquer ar no óleo de imersão, coloque suavemente o suporte da amostra com a amostra montada no estágio do microscópio. Usando a janela de plug-in da UEM no MicroManager 2, mova o estágio piezo até que o sinal do laser de bloqueio de foco seja detectado no fotodiodo do quadrante. Adquira uma imagem do plano focal traseiro em menor potência com um laser a 640 nanômetros de excitação para confirmar a ausência de bolhas de ar no óleo de imersão.
Localize o tecido da gônada usando a iluminação de campo brilhante. Usando uma iluminação de baixa intensidade a 640 nanômetros, concentre-se na seção de tecido contendo muitos complexos sinaptonemais. Proceder à exposição da amostra a alta irradiância com iluminação a 640 nanómetros durante aproximadamente 30 segundos até se atingir uma taxa de piscar adequada.
Adquira 200.000 quadros com um tempo de exposição de 20 milissegundos usando a ferramenta de aquisição multidimensional no MicroManager 2. Enquanto isso, configure a ativação UV usando a opção de ativação do plug-in da UEM para manter a taxa de piscar desejada. O plano mais inferior dos núcleos meióticos contendo complexos sinaptonemais foi visualizado dentro de uma gônada Caenorhabditis elegans usando a coloração HTP-3 e SYP-5.
Os eixos cromossômicos no terminal C do SYP-5 HA foram bem resolvidos em todas as três dimensões em complexos sinaptonemais localizados próximos ao deslizamento da cobertura. No entanto, a resolução se deteriora em complexos sinaptonemais localizados a uma distância de cinco micrômetros da cobertura devido ao espalhamento de luz e aberrações esféricas. Imagens adquiridas a diferentes distâncias piezo da folha de cobertura revelaram que o tecido fotografado não deve estar a mais de dois micrômetros da lâmina de cobertura.
O protocolo de preparo da amostra também pode ser utilizado com microscopia TauSTED. Com o preparo otimizado da amostra, o HTP-3 nos eixos cromossômicos e o C-termini do SYP-5 na região central foram resolvidos em vista frontal e ligeiramente inclinada. Para obter a melhor resolução, as gônadas devem ser reticuladas firmemente à tampa para garantir que os complexos sinaptonemais não estejam a mais de dois micrômetros da deslizamento da cobertura.
Utilizamos este protocolo não apenas para microscopia de localização de molécula única, mas também para microscopia de depleção de emissão estimulada. Também pode ser útil para outras técnicas de microscopia de super resolução.
