À medida que as temperaturas globais continuam a subir, quantificar os limites térmicos e a relação com a aclimatação e a ontogenia são vitais para determinar a vulnerabilidade das espécies ao aquecimento futuro. Para organismos marinhos com histórias de vida complexas, determinar limites térmicos pode ser logisticamente desafiador. Este protocolo introduz um método de pegada pequena e fácil de construir para estimar temperaturas críticas de pequenos organismos planctônicos.
Embora o método tenha sido desenvolvido para plâncton pequeno e de tamanho inferior a um milímetro, ele pode ser adotado para organismos marinhos maiores que caberiam em frascos de cintilação de aproximadamente 50 mililitros de volume. Comece conectando o aquecedor de tiras ao reostato. Faça 60 furos em uma grade de seis por 10 de tamanho para preparar o bloco de alumínio de um tamanho de 20,3 por 15,2 por cinco centímetros e certifique-se de que os furos sejam espaçados dois centímetros de centro a centro em ambas as direções.
Faça dois furos adicionais entre a primeira e a segunda coluna e a nona e a 10ª coluna, correspondendo ao tamanho das sondas controladoras de temperatura. Para manter os elementos no lugar e isolar o bloco de calor completo, construa uma caixa a partir de folhas de acrílico transparente, garantindo a aplicação de duas camadas na parte de trás do elemento de aquecimento. Na montagem final, aplique pasta térmica para maximizar a condutância térmica do elemento de aquecimento para o bloco e do bloco para o elemento de resfriamento.
Conecte o banho-maria com a tubulação Tygon e insira a sonda do termostato nos orifícios na lateral do bloco de alumínio. Em todos os orifícios fresados, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, cheios de água da torneira até a borda. Ligue o controlador de temperatura e defina a temperatura de aquecimento de parada da sonda um para 35 a 37 graus Celsius e a sonda dois para 21,5 a 22,5 graus Celsius.
Gire o reostato para ligar o elemento de aquecimento e defina-o como médio. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura do resfriador para 15 graus Celsius. Usando um termopar com um eletrodo do tipo K, verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga a cada 10 minutos depois.
Ajuste os valores dos pontos finais alterando as configurações do controlador de temperatura e do banho-maria, conforme necessário. Ligue o banho de água recirculante e o aquecedor e defina-os para 15 graus Celsius e 37 graus Celsius, respectivamente, para gerar um gradiente de temperatura de 19,5 graus Celsius a 37 graus Celsius. Uma vez que os tubos de microcentrífuga são colocados em orifícios fresados e a temperatura do bloco de calor é atingida, verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K.
E anote essas temperaturas. Encha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com água do mar, filtrada através de uma malha de 0,45 micrômetro. Concentrar a cultura do organismo em estudo com filtragem reversa para que os organismos permaneçam no fundo do copo.
Enxaguar a cultura concentrada com água do mar filtrada e repetir a filtragem reversa mais uma vez para concentrar a amostra. Conte os pequenos organismos planctônicos sob um microscópio de dissecação e transfira um número conhecido de organismos para tubos de microcentrífuga meio cheios usando uma pipeta de pasteur de vidro. Agora adicione água do mar filtrada até que o volume final nesses tubos atinja um mililitro.
Agora coloque esses tubos em pares no bloco de aquecimento, a partir da extremidade fria para permitir que os organismos se aqueçam gradualmente até a temperatura experimental desejada. Aguarde 10 minutos e mova os pares de tubos de microcentrífuga para os furos perfurados adjacentes com temperaturas mais quentes. Coloque pares adicionais de tubos de microcentrífuga em cada fileira na extremidade fria e continue a deslocá-los para a extremidade mais quente em pares.
Uma vez que todo o bloco esteja cheio, incube-o por duas horas na temperatura designada. No final do período de incubação, meça a temperatura em cada tubo e anote-a. Em seguida, transfira todos os tubos para os suportes pré-rotulados e incube-os a uma temperatura predeterminada por uma hora para permitir a recuperação.
Para enumerar a porção de organismo vivo, transfira o conteúdo de um tubo de microcentrífuga individual em uma placa de Petri de 35 milímetros usando uma pipeta de vidro. Sob um microscópio de dissecação, conte os organismos vivos e mortos e anote os números. O número observado de organismos deve corresponder ao organismo originalmente tomado.
Se isso não acontecer, verifique o lado dos tubos de microcentrífuga e placa de Petri, Gere uma tabela de dados em formato CSV com os cabeçalhos agrupando a variável de interesse, a temperatura do tubo em graus Celsius, o número de indivíduos vivos e o número de indivíduos mortos. Para ajustar os dados com uma regressão logística, use um modelo linear generalizado com uma distribuição binomial. Para executar o modelo, digite source e use o arquivo R, modelloop.r.
Calcule os valores preditores nos quais 50% dos indivíduos sobreviveram, para determinar o limite térmico superior mediano. Usando este protocolo, a sobrevivência de larvas de areia dólares foi medida, que foi através de uma faixa de temperatura de 19 a 37 graus Celsius, em dois, quatro e seis dias após a fertilização. À medida que os dólares de areia larval se desenvolveram, o limite térmico superior aumentou de 28,6 graus Celsius em dois dias após a fertilização, para 28,8 graus Celsius em quatro dias após a fertilização e aproximadamente 29 graus Celsius em seis dias após a fertilização.
Os tempos de incubação e recuperação são específicos da espécie. É importante realizar um teste preliminar para garantir que o tempo selecionado produza uma estimativa viva versus morta confiável.
