Nós agradecem T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, e B. Wallek em Lynntech, Inc. para assistência técnica e muitas discussões úteis. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation EUA (NSF), sob concessão CBET-0933688.

1. Projeto Básico do Termociclador por convecção <ol><li> Temos construído um dispositivo simples termociclagem convectivas consistindo de plástico intercambiáveis ​​reação de câmara &quot;cartuchos&quot; que são colocados entre duas placas de alumínio, cuja temperatura é controlada de forma independente 7 (Figura 2). </li><li> Poços reator cilíndrico são incorporados por matrizes de usinagem de furos nos blocos de policarbonato, com diferentes combinações de diâmetro do furo e espessura da chapa de plástico utilizados para alcançar as proporções desejadas (altura / diâmetro = h / d). Duas geometrias diferentes reator são considerados nos resultados apresentados aqui: h / d = 9: h = 15.9 mm, d = 1,75 mm, volume de 38,2 mL; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 mL volume. </li><li> A superfície inferior do reator é aquecida através de um bloco de alumínio contendo aquecedores de cartucho de interface com um controlador de temperatura microprocesser conduzido. </li><li> A temperatura na superfície superior do reator é regulada através de um bloco de alumínio conectado a um banho de água de recirculação. </li><li> Todo o conjunto é preso em conjunto, utilizando parafusos de nylon para limitar a condução térmica entre os blocos de alumínio adversária. </li></ol> 2. Preparação e carregamento da mistura de reação de PCR <ol><li> Um típico 100 mL mistura de reação contém 10 mL de solução-tampão 10x, 6 mL de 25 mM MgCl 2, 10 mL de dNTPs (2 mM cada), 41,2 mL de água DI, 10 mL de β-actina sonda, 10 mL de β -actina cartilha para a frente, 10 mL de β-actina primer reverso, 2 mL de DNA genômico modelo humano (10 ng / mL) e 0,8 mL de Kod DNA polimerase (2,5 unidades / mL). </li><li> Antes de carregar reagentes, selar a superfície inferior da câmara de PCR usando uma folha fina de fita de alumínio. </li><li> Lave os poços com um reator de 10 mg / ml de solução aquosa de albumina de soro bovino seguido por Rain-X Anti-Fog. </li><li> Reagentes pipeta no reator usando poços longo dicas gel de carregamento de pipeta e selar a superfície superior com fita Teflon FEP. </li></ol> 3. Executando a reação no termociclador por convecção <ol><li> Antes de iniciar a reação, os blocos de pré-aquecimento de alumínio tanto para o desejado temperaturas da superfície superior e inferior. </li><li> Sandwich do reator de plástico carregado com PCR reagentes entre os blocos de aquecimento de alumínio, pinça e rapidamente a montagem em conjunto, utilizando parafusos de nylon. </li><li> Após a reação prosseguiu para o tempo desejado, desligue os aquecedores e coloque a superfície inferior (quente) do dispositivo em cima de um bloco de metal refrigerados rapidamente resfriá-lo e parar o fluxo convectivo. </li><li> Remova o reator de plástico e pipeta os produtos para fora dos poços (com as dicas de carga de longo gel) para posterior análise. </li></ol> 4. Realização de análise Eletroforese em Gel <ol><li> Prepare a 2% em peso agarose gel por aquecimento de 10 g de agarose com 500 mL de tampão 1x em uma placa quente mexendo até que a solução se torna claro. </li><li> Carregar o gel agarose na bandeja de fundição e inserir o pente. Deixe o conjunto de gel para ~ 30 min. </li><li> Retirar o pente e adicionar tampão TAE 1x até que o gel está submerso. </li><li> Fluorescente amostras de DNA manchado conter 2 mL 100x SYBR Green solução I, 2 mL de amostra de DNA, 2 mL Dye Carregando 6x Orange, e 4 tampão TAE mL. </li><li> Adicionar as amostras de DNA para os poços e executar a separação em 60 V para 1 h com uma bp DNA ladder 100 marcador de dimensionamento. </li><li> Remover o gel e fotografá-lo sob a luz UV para obter o resultado. </li></ol> 5. Resultados representativos: Projeto ótimo de termocicladores convectivas envolve a escolha correta da geometria do reator que irá gerar um fluxo circulatório capaz de transportar os reagentes através da chave temperaturas envolvidas no processo de PCR. Os parâmetros geométricos que podem ser variadas nos reatores cilíndricos aqui considerados são a altura (h) e diâmetro (d), ou equivalentemente a proporção (h / d). Nós exploramos os campos 3-D do fluxo dentro convectivas reatores PCR em um intervalo de proporções diferentes, utilizando dinâmica de fluidos computacional (CFD), e descobriram que os padrões complexos podem surgir inesperadamente. Mais importante ainda, nossa análise revelou um subconjunto desses campos fluxo complexo que acelerar significativamente a reação 12. Estes efeitos geométricos podem ser vistos claramente, comparando os campos de fluxo em reatores em proporções altas e baixas. No caso de alta proporção (h / d = 9; um cilindro alto e magro), elementos de fluido são advected ao longo de trajetórias traçando caminhos que são essencialmente fechado loops, e eles são locked-in para seguir os mesmos caminhos por longos períodos de tempo (Figura 3a). Conseqüentemente, há pouca oportunidade de intercâmbio entre ftrajetórias baixo que exponha os reagentes para a seqüência ideal de condições térmicas para a PCR (oscilando entre o recozimento e desnaturação extremos em superfícies superior e inferior do reator) eo conjunto muito maior de trajetórias restantes que não contribuem para a amplificação (localizada mais perto do centro do reator). O campo de fluxo é muito diferente em uma proporção menor de aspecto (h / d = 3; um curto cilindro, mais amplo), tornando-se mais caótica no sentido de que as trajetórias elemento de fluido não seguem caminhos fechados (Figura 3b). Assim, embora os reagentes são submetidos a um perfil de temperatura mais complexos, os elementos fluidos são capazes de explorar uma gama muito maior de trajetórias para que mais do volume de reagente tem uma ótima oportunidade de experimentar perfis térmicos. Estes resultados sugerem que, embora contraintuitivamente trajetórias de fluxo individuais em h / d = 09 de maio parecem ser mais favoráveis ​​para a PCR, produzindo perfis de temperatura que &quot;olhar&quot; similares aos empregados em um termociclador convencional, a natureza caótica do campo de fluxo em h / d = 3, em última análise domina em uma escala global, promovendo maior intercâmbio para que os reagentes não ficam presas em trajetórias desfavoráveis ​​por muito tempo. Para testar essa hipótese e determinar qual a geometria do reator foi mais favorável para a PCR, usamos os dois para realizar a replicação PCR de um alvo de 295 bp associado com o gene β-actina de um modelo de DNA genômico humano. Notavelmente, rotineiramente alcançados amplificação do produto alvo correto em apenas 10 min em h / d = 3 (Figura 4a), enquanto a mesma reação necessários pelo menos 20 minutos antes de os produtos detectáveis ​​foram observadas em h / d = 9 (Figura 4b) . A especificidade de reação também é muito maior em h / d = 3, onde um produto PCR simples é obtido, enquanto vários produtos inespecíficos são gerados em h / d = 9, onde as armadilhas do fluxo líquido no campo de elementos desfavoráveis ​​trajetórias térmica por longos períodos de tempo. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Convecção térmica em uma câmara cilíndrica, cuja parte superior e inferior superfícies são mantidas em diferentes temperaturas fixas. Se a temperatura na superfície inferior é maior do que no topo, um gradiente de densidade vertical é estabelecida dentro do fluido fechado que é capaz de gerar um padrão de fluxo circulatório. Com a escolha certa de parâmetros geométricos (altura e diâmetro d h), o campo de fluxo convectivo pode ser aproveitada para accionar termociclagem PCR quando as superfícies superior e inferior são manintained perto recozimento e temperaturas de desnaturação, respectivamente (a gravidade atua verticalmente para baixo). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Os principais componentes de um fluxo de convecção PCR thermocyler. Um cartucho de reator consiste de um bloco de policarbonato contendo um conjunto de câmaras cilíndricas. O bloco está entre uma placa superior projetado para ser conectado a um banho de água circulante e uma placa inferior incorporando aquecedores embutidos. (B) Os reagentes PCR são carregados e lacrados dentro do cartucho do reator, após o qual o dispositivo é montado para realizar a reação. Após a conclusão, o procucts pode ser facilmente pipetado para análises posteriores. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Simulações computacionais de 3-D campos fluxo convectivo gerado dentro de reatores cilíndricos com temperaturas de 53 e 96 ° C impostas nas superfícies superior e inferior, respectivamente. Resultados são mostrados na razão de aspecto de (a) h / d = 9 (38,2 mL de volume do reator) e (b) h / d = 3 (18,5 mL de volume do reator). A trajetória representante seguido por um elemento fluido viajar através do campo de fluxo 3D é mostrado à esquerda junto com projeções vista superior e lateral do caminho; a trama correspondente da temperatura versus tempo após um elemento de fluido é mostrado à direita. O perfil térmico em 9 = h / d aparece próximo ao de um termociclador convencional, mas o campo de fluxo caótico, 3 = h / d é contraintuitivamente mais favorável para PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. DNA replicação resultados obtidos nas geometrias reator mostrado na Figura 3 (superior e inferior superfícies foram mantidas em 53 e 96 ° C, respectivamente). (A) PCR é muito acelerado, 3 = h / d, como é evidente pelos produtos fortes visível após apenas 10 min de tempo de reação (M: 100 bp ladder, faixas 1-4: produtos de reações paralelas em 4 diferentes câmaras cilíndricas). (B </strong&gt;) A mesma reação realizada em 9 = h / d exige pelo menos 20 minutos antes de os produtos visíveis são observadas, e várias bandas estão indicando replicação evidente de não-específica do DNA alvo, além do produto desejado (M: 100 bp ladder, faixas 1-2: produtos de reações paralelas em duas diferentes câmaras cilíndricas).

<ol>
	<li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Techniques:+Reviews+and+Protocols.">Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2005).</li><li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+in+a+Rayleigh-B&#233;nard+convection+cell.">PCR in a Rayleigh-B&#233;nard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li><li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection.">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li><li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosiphon-based+PCR+reactor:+experiment+and+modeling.">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li><li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler.">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li><li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems.">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li><li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling.">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li><li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system.">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler.">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li><li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems:+A+convection-diffusion-reaction+model.">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li><li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR.">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li><li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring.">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A interação entre fluxo e reação química pode mudar drasticamente sob a influência da advecção caótica. Mas estes estados de fluxo complexos são difíceis de estudar, principalmente em geometrias realista, onde os efeitos 3D tornar-se importante. Rayleigh-Bénard convecção em h / d&gt; 1 não só fornece uma plataforma conveniente para explorar esses fenômenos, a sua aplicação para realizar PCR também permite o acoplamento entre o fluxo e reações químicas a ser sondado. Esta capacidade única faz com que seja possível selecionar os estados fluxo ideal onde atuam efeitos caóticos (contraintuitivamente) para acelerar a taxa de replicação do DNA.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

Muitos ensaios de biologia molecular dependem de alguma forma na reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar uma amostra de DNA inicialmente diluir-alvo a um nível de concentração detectável. Mas o projeto de hardware convencional termociclagem PCR, predominantemente baseada em blocos de metal maciço aquecimento cuja temperatura é regulada por aquecedores termelétricas, limita severamente a velocidade de reação viável 1. Considerável de energia elétrica também é necessário para repetidamente aquecer e resfriar a mistura de reagentes, limitando a capacidade de implantar estes instrumentos em um formato portátil. Convecção térmica emergiu como uma abordagem promissora alternativa termociclagem que tem o potencial para superar essas limitações 2-9. Fluxos convectivos são uma ocorrência diária em um diversificado leque de configurações que vão desde a atmosfera da Terra, oceanos e interior, para lâmpadas de lava decorativos e coloridos. Movimento fluido é iniciado da mesma forma que em cada caso: a instabilidade flutuabilidade impulsionado surge quando um volume confinado de fluido é submetido a um gradiente de temperatura espacial. Esses mesmos fenômenos oferecem uma maneira atraente para executar termociclagem PCR. Pela aplicação de um gradiente de temperatura estática através de uma geometria do reator adequadamente concebido, um fluxo contínuo do aparelho circulatório pode ser estabelecido que o transporte repetidamente reagentes PCR através de zonas de temperatura associadas com a desnaturação, anelamento, extensão e estágios da reação (Figura 1). Termociclagem pode ser acionado de forma pseudo-isotérmicas, simplesmente segurando duas superfícies opostas em temperaturas fixas, eliminando completamente a necessidade de repetidamente aquecer e resfriar o instrumento. Um dos principais desafios de design de termocicladores convectivo é a necessidade de controlar com precisão a velocidade espacial e distribuições de temperatura dentro do reactor para assegurar que os reagentes seqüencialmente ocupam as zonas de temperatura correta para um período de tempo suficiente 10,11. Aqui nós descrevemos os resultados de nossos esforços para investigar a velocidade 3-D cheio e distribuições de temperatura em microescala termocicladores convectivas 12. Inesperadamente, descobrimos um subconjunto de trajetórias de fluxo complexos que são altamente favoráveis ​​para a PCR, devido a uma combinação sinérgica de (1) intercâmbio permanente entre os caminhos de fluxo que fornece uma oportunidade maior para os reagentes para experimentar toda a gama de perfis de temperatura ideal, e ( 2) aumento do tempo gasto dentro da zona de temperatura a taxa de extensão etapa limitante da PCR. Extremamente vezes DNA rápida amplificação (menos de 10 min) são realizáveis ​​em reatores projetados para gerar esses fluxos.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection at JoVE.com

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Descrevemos um novo método para realizar a replicação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Convecção térmica é aproveitada para reagentes shuttle continuamente entre desnaturação, anelamento e extensão através da manutenção de condições de superfícies opostas do reator a uma temperatura constante. Este projeto inerentemente simples promete fazer uma rápida PCR mais acessível.

Rápida ciclagem térmica PCR usando convecção térmica em micro

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K visualizações.  Texas A&M University. Descrevemos um novo método para realizar a replicação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Convecção térmica é aproveitada para reagentes shuttle continuamente entre desnaturação, anelamento e extensão através da manutenção de condições de superfícies opostas do reator a uma temperatura constante. Este projeto inerentemente simples promete fazer uma rápida PCR mais acessível.

Vídeo: Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

A genotipagem rápida de tecido Mouse Usando Extract-N-Amp Tissue Sigma PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Detecção otimizada baseados em PCR de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

Detectando a doença de Lyme espiroqueta, a Borrelia Burgdorferi, em carrapatos usando PCR aninhado

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...