Esta pesquisa foi financiada em parte por um Conselho Consultivo de Pesquisa da Universidade de Connecticut, Faculty Large Grant, para M. Rubega. K. Burgio foi apoiado na Fundação Nacional de Ciência NRT- IGE #1545458 de bolsas para M. Rubega. O manuscrito foi significativamente melhorado pelo feedback atencioso de dois revisores anônimos.

Este trabalho não envolveu nenhum trabalho com animais vivos e, portanto, foi isento de revisão de cuidados com animais.
1. Configuração e materiais (Figura 1)
<ol><li>Se as peles planas da espécie de interesse não estiverem disponíveis, use o protocolo29 da Spaw para criar peles de espécimes frescos ou congelados. Preen penas em uma posição limpa, natural e seca para obter um peso constante antes de prosseguir com as medidas.</li>
	<li>Configure um banho de água quente de temperatura constante. NOTA: Esta configuração é bastante alta, por isso é mais fácil colocar o banho de água quente no chão.</li>
	<li>Coloque uma folha de vidro acrílico clarosobrea superfície do banho de água quente de temperatura constante. O vidro permite a transmissão do calor para a parte inferior da pele sem molhar o espécime. NOTA: Este estudo piloto utilizou uma folha de vidro acrílico (0,125 de espessura). A espessura do vidro não afetará a emissividade30 do material (sempre será 0,86), mas afetará a temperatura absoluta na superfície do vidro (ouseja, o vidro mais grosso resultará em uma temperatura mais baixa). Assim, todas as medidas devem ser tomadas utilizando uma folha de vidro acrílico da mesma espessura.</li>
	<li>Coloque um pedaço de placa do núcleo de espuma (1 em espessura) com um orifício circular (0,5 de diâmetro) sobre o vidro acrílico. NOTA: O tamanho da ave deve guiar o tamanho do orifício e, portanto, o tamanho das penas ininterruptas recebendo calor da fonte. Aqui, é utilizado um orifício de 0,5 de diâmetro, pois este tamanho é grande o suficiente para alcançar transmissão térmica suficiente para o espécime, enquanto ainda é pequeno o suficiente para centralizar o calor sob os tratos de penas de peito (de todas as aves, exceto as menores). Independentemente do tamanho da abertura térmica, para obter um valor comparável e replicável para cada pássaro, certifique-se de realizar medições com orifícios do mesmo tamanho.</li>
	<li>Conecte uma câmera térmica a um tripé diretamente acima da configuração na distância mínima de foco da câmera. NOTA: Aqui, é utilizada uma câmera térmica FLIR SC655 (resolução de 680 px x 480 px, ±2 °C ou ±2% de precisão de leitura, 40 cm de distância mínima de foco). Outras câmeras podem diferir em resolução de grau.</li>
	<li>Calibrar a câmera digitando o seguinte no software da câmera térmica:<ol>
<li>Encontre a temperatura refletida colocando papel alumínio (lado brilhante voltado para cima) sobre a espuma com o valor de emissividade definido para 1.0 no software de calibração da câmera. Tire uma imagem térmica. A temperatura na superfície da folha de alumínio é a temperatura refletida, que deve ser semelhante à temperatura ambiente da sala.</li>
		<li>Defina o valor da emissividadede 31 a 0,95. NOTA: 1) Emissividade é a quantidade relativa de calor que um objeto emite32 e varia de 0 a 1. Um objeto com alto valor de emissividade emite uma grande quantidade de calor, enquanto um objeto com baixo valor de emissividade irradia pouco calor32. Esse valor representa a emissividade das penas. 2) Esse valor (0,95) é contestado. Cossins e Bowler alegaram que as penas têm um valor de emissividade entre 0,90-0,95, mas não incluíram nenhuma evidência31. Hammel relatou um valor de 0,98, mas obteve esse valor de um espécime congelado, portanto pode não ser preciso33. Apesar da falta de evidências, a emissividade 0,95 é o valor mais utilizado na literatura de câmeras térmicas (como evidenciado por Cossins e Bowler31).</li>
		<li>Certifique-se de que a temperatura ambiente e a umidade no quarto são constantes. Esses valores devem ser medidos antes de cada medição e atualizados no software de calibração da câmera. A temperatura e a umidade de todas as salas internas flutuarão um pouco, então registrar esses valores e atualizá-los no software reduz o erro de medição. NOTA: Aqui, o software FLIR ResearchIR Max é usado. Este software não salva dados para todas as imagens, por isso é crucial registrar todos esses valores para cada imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Desempenho das medições
<ol><li>Coloque a temperatura constante de banho de água quente a uma temperatura-alvo (40 °C é um proxy para a temperatura média interna do núcleo da maioria das aves transeuntes)34. NOTA: Se trabalhar com uma espécie cuja temperatura do núcleo de repouso é maior (por exemplo, beija-flores34) ou inferior (por exemplo, pinguins34 ou ratites34,35), pode ser apropriado ajustar o banho de água quente em conformidade. A Figura 3 mostra a relação entre a temperatura do banho de água quente e a temperatura na superfície do vidro acrílico (por exemplo, a temperatura real da fonte de calor a que a pele plana está exposta).<ol>
<li>Os resultados obtidos a partir deste protocolo (ver Figura 5) sugerem que a obtenção de medições em uma faixa de temperaturas também é informativa das diferenças de desempenho térmico. Para isso, siga o protocolo usando incrementos de 5 °C de 30 a 55 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>No software da câmera térmica, desenhe um círculo/elipse sobre o orifício na espuma onde o calor está escapando. Isso permite visualizar essa área ao colocar a pele na espuma para garantir que a área correta na pele plana seja medida.</li>
	<li>Coloque o espécime de pele plana na espuma com a área de interesse sobre o orifício. NOTA: Aqui, a região da barriga de cada pássaro é medida, pois não é obstruída por outras partes do corpo, como a asa e está localizada centralmente o suficiente para não ser submetida a efeitos de borda. A colocação da pele sobre o orifício de calor vai variar de acordo com a questão experimental. Em geral, recomenda-se a colocação diretamente sobre um trato de penas, e o mais longe possível da borda da pele. Certifique-se de não achatar ou desordenar as penas ao colocar a pele. Se necessário, preená-los em uma posição natural uma vez que a pele é colocada.</li>
	<li>Espere 15 min para permitir que a pele se aclimata à fonte de calor. Se as medidas forem feitas muito cedo, o valor da temperatura na superfície da camada de penas será muito baixo. Aqui, a transmissão de temperatura através da pele e das penas estabilizou em 15 minutos, então esperar mais de 15 min não produzirá um resultado artificialmente alto.</li>
	<li>Tirando uma imagem térmica da pele plana.<ol>
<li>Defina o valor de emissividadede 31 a 0,95 antes de tirar a imagem térmica.</li>
	</ol></li>
	<li>Remova a pele da espuma e pegue imediatamente uma imagem térmica da configuração sem a pele plana na espuma. Isso quantifica a temperatura na superfície do vidro acrílico e calibra a área da fonte de calor com a área de medição na pele plana.<ol>
<li>Aqui, a emissividade do vidro acrílico usado30 é 0,86. Certifique-se de gravar isso no software da câmera térmica antes de tirar a foto sem a pele. NOTA: A temperatura exibida pelo banho de água quente não é necessariamente a temperatura na superfície do vidro acrílico(Figura 3),uma vez que sua condução térmica não é perfeita. Usar a temperatura do vidro reduz os erros na estimativa de quão quente é a parte inferior da pele e, portanto, é uma estimativa combinada de quanto calor é perdido através da pele e das penas.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque a pele de volta na espuma na mesma posição. Repita as etapas 2.5-2.6 para um total de cinco ensaios.<ol>
<li>Para colocar a pele do espécime corretamente, toque suavemente as penas na área de medição do alvo com uma ponta de dedo, em seguida, remova o dedo e veja a imagem térmica. O calor residual do dedo permanecerá visível brevemente na imagem térmica. Verifique se a área de amostragem está dentro do círculo visível desenhado no software, que representa a área de calor irradiando através da pele a partir do banho de água quente. Se não for, mova a pele até que esteja. Este processo é ilustrado na Figura 2. NOTA: Embora as peles frescas (quando disponíveis) possam representar o desempenho térmico natural da pele em um pássaro vivo mais de perto, o uso de peles secas para essas medidas permitem resultados comparáveis e repetitivos em um pool muito maior de espécimes. Portanto, todas as medidas devem ser tomadas usando peles secas a peso constante, ou na pele fresca e seca dos espécimes.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Coleta de dados a partir de imagens térmicas
<ol><li>Cada medição consiste em duas imagens térmicas: uma da pele plana e uma do vidro acrílico. Primeiro, abra a imagem do vidro acrílico. Alinhe o círculo desenhado no software com o orifício na espuma visível na imagem. Regisso valor da temperatura no centro do círculo. NOTA: Para obter mais detalhes sobre a extração de dados de imagens térmicas, consulte Senior et al.36.<ol>
<li>Certifique-se de calibrar a câmera com os valores adequados. Defina a emissividadede 30 a 0,86 e defina a temperatura ambiente e a umidade para corresponder às condições atuais no laboratório, antes de registrar o valor da temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abra a imagem térmica da pele plana. Sem mover o círculo, regisse o valor da temperatura no centro do círculo. NOTA: Como o círculo não está registrado na imagem, é importante calibrar a colocação do círculo com a imagem do vidro acrílico tirada na seção 2.6.<ol>
<li>Certifique-se de calibrar a câmera com os valores adequados. Defina a emissividadede 31 a 0,95, e certifique-se de definir a temperatura ambiente e a umidade para as condições atuais no laboratório, antes de registrar o valor da temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita as etapas 3.1-3.2 para todas as medições de todas as amostras.</li>
</ol>4. Cálculo do desempenho térmico
<ol><li>Subtraia a temperatura da superfície do casaco de penas da temperatura do vidro acrílico. Este valor representa o calor retido pelo casaco de penas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feather+Postures+of+Birds+and+the+Problem+of+the+Origin+of+Social+Signals.">The Feather Postures of Birds and the Problem of the Origin of Social Signals.</a> Behaviour. 9, 75-111 (1956).</li><li>Wetmore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Study of the Body Temperature of Birds. Smithsonian Miscellaneous Collections. 72 (12), (1921).</li><li>Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Acclimatization+in+Four+Species+of+Small+Wild+Birds.">Seasonal Acclimatization in Four Species of Small Wild Birds.</a> Physiological Zoology. 35 (3), 224-236 (1962).</li><li>Veghte, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+and+Metabolic+Responses+of+the+Gray+Jay+to+Cold+Stress.">Thermal and Metabolic Responses of the Gray Jay to Cold Stress.</a> Physiological Zoology. 37 (3), 316-328 (1964).</li><li>Brush, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+Temperature+Regulation+and+Circulation+in+Resting,+Active+and+Defeathered+California+Quail,+Lophortyx+californicus.">Energetics, Temperature Regulation and Circulation in Resting, Active and Defeathered California Quail, Lophortyx californicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 15, 399-421 (1965).</li><li>Dawson, W. R., Carey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Acclimatization+to+Temperature+in+Cardueline+Finches.">Seasonal Acclimatization to Temperature in Cardueline Finches.</a> Journal of Comparative Physiology. 112, 317-333 (1976).</li><li>Cooper, S. J., Swanson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Acclimatization+of+Thermoregulation+in+The+Black-Capped+Chickadee.">Seasonal Acclimatization of Thermoregulation in The Black-Capped Chickadee.</a> The Condor. 96, 638-646 (1994).</li><li>Bush, N. G., Brown, M., Downs, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Effects+on+Thermoregulatory+Responses+of+the+Rock+Kestrel,+Falco+rupicolis.">Seasonal Effects on Thermoregulatory Responses of the Rock Kestrel, Falco rupicolis.</a> Journal of Thermal Biology. 33, 404-412 (2008).</li><li>Nzama, S. N., Downs, C. T., Brown, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Variation+in+the+Metabolism-Temperature+Relation+of+House+Sparrows+(Passer+domesticus)+in+KwaZulu-Natal,+South+Africa.">Seasonal Variation in the Metabolism-Temperature Relation of House Sparrows (Passer domesticus) in KwaZulu-Natal, South Africa.</a> Journal of Thermal Biology. 35, 100-104 (2010).</li><li>Noakes, M. J., Wolf, B. O., McKechnie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Metabolic+Acclimatization+Varies+in+Direction+and+Magnitude+among+Populations+of+an+Afrotropical+Passerine+Bird.">Seasonal Metabolic Acclimatization Varies in Direction and Magnitude among Populations of an Afrotropical Passerine Bird.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 90 (2), 178-189 (2016).</li><li>Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+insulation+of+the+down+and+feathers+of+pygoscelid+penguin+chicks+and+the+unique+properties+of+penguin+feathers.">Thermal insulation of the down and feathers of pygoscelid penguin chicks and the unique properties of penguin feathers.</a> The Auk. 103 (1), 160-168 (1986).</li><li>Ward, J. M., Houston, D. C., Ruxton, G. D., McCafferty, D. J., Cook, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+resistance+of+chicken+(Gallus+domesticus)+plumage:+a+comparison+between+broiler+and+free-range+birds.">Thermal resistance of chicken (Gallus domesticus) plumage: a comparison between broiler and free-range birds.</a> British poultry science. 42 (5), 558-563 (2001).</li><li>Ward, J. M., Ruxton, G. D., Houston, D. C., McCafferty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+consequences+of+turning+white+in+winter:+a+comparative+study+of+red+grouse+Lagopus+lagopus+scoticus+and+Scandinavian+willow+grouse+L.+l.+lagopus.">Thermal consequences of turning white in winter: a comparative study of red grouse Lagopus lagopus scoticus and Scandinavian willow grouse L. l. lagopus.</a> Wildlife Biology. 13 (2), 120-130 (2007).</li><li>Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Avian Anatomy: Integument. , (1972).</li><li>Osv&#225;th, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+feathered+are+birds?+Environment+predicts+both+mass+and+density+of+body+feathers.">How feathered are birds? Environment predicts both mass and density of body feathers.</a> Functional Ecology. 32, 701-712 (2018).</li><li>Pap, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogenetic+comparative+analysis+reveals+correlations+between+body+feather+structure+and+habitat.">A phylogenetic comparative analysis reveals correlations between body feather structure and habitat.</a> Functional Ecology. 31 (6), 1241-1251 (2017).</li><li>Caccamise, D. F., Weathers, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Winter+Nest+Microclimate+of+Monk+Parakeets.">Winter Nest Microclimate of Monk Parakeets.</a> The Wilson Bulletin. 89 (2), 346-349 (1977).</li><li>Broggi, J., Gamero, A., Hohtola, E., Orell, M., Nilsson, J. &. #. 1. 9. 7. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpopulation+variation+in+contour+feather+structure+is+environmentally+determined+in+great+tits.">Interpopulation variation in contour feather structure is environmentally determined in great tits.</a> PLoS ONE. 6 (9), 24942 (2011).</li><li>Howell, S. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molt in North American Birds. , (2010).</li><li>Willoughby, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unusual+Sequence+of+Molts+and+Plumages+in+Cassin's+and+Bachman's+Sparrows.">An Unusual Sequence of Molts and Plumages in Cassin's and Bachman's Sparrows.</a> The Condor. 88 (4), 461-472 (1986).</li><li>Wetmore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Number+of+Contour+Feathers+in+Passeriform+and+Related+Birds.">The Number of Contour Feathers in Passeriform and Related Birds.</a> Auk. 53, 159-169 (1936).</li><li>Staebler, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+Contour+Feathers+in+the+English+Sparrow.">Number of Contour Feathers in the English Sparrow.</a> The Wilson Bulletin. 53 (2), 126-127 (1941).</li><li>Barnett, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Changes+in+Temperature+Acclimatization+of+the+House+Sparrow,+Passer+domesticus.">Seasonal Changes in Temperature Acclimatization of the House Sparrow, Passer domesticus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 33, 559-578 (1970).</li><li>Middleton, A. L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+Changes+in+Plumage+Structure+and+Body+Composition+of+the+American+Goldfinch,+Carduelis+tristis.">Seasonal Changes in Plumage Structure and Body Composition of the American Goldfinch, Carduelis tristis.</a> The Canadian Field-Naturalist. 100 (4), 545-549 (1986).</li><li>Lei, F. M., Qu, Y. H., Gan, Y. L., Gebauer, A., Kaiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+feather+microstructure+of+Passerine+sparrows+in+China.">The feather microstructure of Passerine sparrows in China.</a> Journal f&#252;r Ornithologie. 143 (2), 205-213 (2002).</li><li>D'alba, L., Carlsen, T. H., &#193;sgeirsson, &. #. 1. 9. 3. ;., Shawkey, M. D., J&#243;nsson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+feather+microstructure+to+eider+down+insulation+properties.">Contributions of feather microstructure to eider down insulation properties.</a> Journal of Avian Biology. 48 (8), 1150-1157 (2017).</li><li>Gilbert, C., Robertson, G., Le Maho, Y., Naito, Y., Ancel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huddling+behavior+in+emperor+penguins:+dynamics+of+huddling.">Huddling behavior in emperor penguins: dynamics of huddling.</a> Physiology &amp; Behavior. 88, 479-488 (2006).</li><li>Kvadsheim, P. H., Folkow, L. P., Blix, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+measurement+of+the+thermal+conductivity+of+fur+and+blubber.">A new device for measurement of the thermal conductivity of fur and blubber.</a> Journal of thermal Biology. 19 (6), 431-435 (1994).</li><li>Spaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Combination Specimens a la Burke Museum. , 21-28 (1989).</li><li>Infrared Emissivity Table. ThermoWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermoworks.com/emissivity_table">https://www.thermoworks.com/emissivity_table</a> (2019)</li><li>Cossins, A. R., Bowler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Temperature Biology of Animals. , (1987).</li><li>Hammel, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+Emissivities+of+Some+Arctic+Fauna.">Infrared Emissivities of Some Arctic Fauna.</a> Journal of Mammalogy. 37 (3), 375-378 (1956).</li><li>McNab, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Analysis+of+the+Body+Temperatures+of+Birds.">An Analysis of the Body Temperatures of Birds.</a> The Condor. 68 (1), 47-55 (1966).</li><li>Crawford, E. C., Lasiewski, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption+and+Respiratory+Evaporation+of+the+Emu+and+Rhea.">Oxygen Consumption and Respiratory Evaporation of the Emu and Rhea.</a> The Condor. 70, 333-339 (1968).</li><li>Senior, R. A., Hill, J. K., Edwards, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThermStats:+An+R+Package+for+Quantifying+Surface+Thermal+Heterogeneity+in+Assessments+of+Microclimates.">ThermStats: An R Package for Quantifying Surface Thermal Heterogeneity in Assessments of Microclimates.</a> Methods in Ecology and Evolution. 10, 1606-1614 (2019).</li><li>. FLIR Systems, Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.flir.com">https://www.flir.com</a> (2019)</li><li>McCafferty, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+thermal+imaging+in+avian+science.">Applications of thermal imaging in avian science.</a> Ibis. 155 (1), 4-15 (2013).</li><li>Boonstra, R., Eadie, J. M., Krebs, C. J., Boutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+Far+Infrared+Thermal+Imaging+in+Locating+Birds.">Limitations of Far Infrared Thermal Imaging in Locating Birds.</a> Journal of Field Ornithology. 66 (2), 192-198 (1955).</li><li>Rodbard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+and+Body+Temperature.">Weight and Body Temperature.</a> Science. 111 (2887), 465-466 (1950).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo fornece um protocolo para medições de imagem térmica repetíveis e padronizadas de amostras de pele plana aviária. Este método permite comparar o desempenho térmico da camada de penas entre espécies, dentro das espécies, entre indivíduos comparáveis, e em diferentes locais nos corpos dos indivíduos, tudo sem destruição do espécime.
A disponibilidade de materiais e equipamentos necessários pode ser uma limitação deste método. Embora as câmeras térmicas estejam ra...

As penas são a característica definidora das aves e servem muitas funções, entre as mais cruciais sendo o isolamento1. As aves têm as maiores temperaturas médias do núcleo de qualquer grupo de vertebrados, e as penas isolando-as das mudanças de temperatura ambiental são uma parte vital do equilíbrio energético, especialmente em ambientes frios2. Apesar da importância das penas, a maioria da literatura sobre mudanças na condição térmica nas aves tem focado nas respostas metabólicas à variação da temperatura em vez da função das penas como isolamento3,4,5,6,7,8,9,10 (para maiores detalhes, consulte Ward et al.) 11,12,13. No entanto, as penas em si podem variar ao longo do tempo, indivíduos e espécies.
O método aqui apresentado é útil para quantificar apenas o valor térmico total do casaco de penas. Remove fatores confusos em aves vivas, como termoregulação comportamental1 e quantidades variadas de gordura isolante. Uma medição mais difundida do desempenho térmico dos casacos de penas é necessária para melhorar a compreensão de como as penas contribuem para o isolamento e como isso varia entre e dentro das espécies ao longo da história de vida e do ciclo anual de uma ave.
As penas isolam as aves prendendo o ar tanto entre a pele e as penas quanto dentro das penas, e criam uma barreira física para a perda de calor14. As penas consistem em um eixo central de penas, chamado rachis, com projeções chamadas farpas14. Os barbulos são pequenas projeções secundárias em farpas que se entrelaçam com farpas adjacentes para "fechar" a pena e dar-lhe estrutura. Além disso, as penas para baixo carecem de um rachis central e têm poucos bulos, formando assim uma massa solta e isolante de farpas sobre a pele14. As camadas de penas variam entre as espécies15,16, dentro das espécies17,18, e dentro dos indivíduoscomparáveis 2,19,20,21,22,23,24. No entanto, há pouca informação quantitativa sobre como variações no número de penas, a abundância relativa de diferentes tipos de penas em um pássaro, ou mudanças no número de farpas/barbulos afetam o desempenho térmico geral de um casaco de penas. Estudos anteriores se concentraram em determinar um único valor médio de isolamento e condutividade térmica para uma determinada espécie11,12,13.
O casaco de penas é conhecido por variar entre as espécies. Por exemplo, a maioria das aves tem áreas distintas de pele das quais as penas crescem, ou não, chamadas de pterylae e apteria,respectivamente 14. A colocação do pterylae (às vezes chamado de "tratos de penas") varia entre as espécies e tem algum valor como caráter taxonômico14. No entanto, algumas aves (ou seja, ratites e pinguins) perderam essa pterylosis e têm uma distribuição uniforme de penas em todo o corpo14. Além disso, diferentes espécies, especialmente aquelas que habitam ambientes diferentes, possuem proporções diferentes dos tipos de penas15. Por exemplo, aves que habitam climas mais frios têm penas mais para baixo15 e penas de contorno com uma porção plumulaceous maior16 do que espécies que habitam ambientes mais quentes.
A microestrutura de certos tipos de penas também pode ter um efeito sobre o isolamento entre as espécies25,26. Lei et al. compararam a microestrutura das penas de contorno de muitos pardais passantes chineses e descobriram que as espécies que habitam ambientes mais frios têm uma proporção maior de farpas plumurosas em cada pena de contorno, barras mais longas, maior densidade de nó e nódulos maiores do que espécies que habitam ambientes mais quentes25. D'alba et al. comparou a microestrutura de penas para baixo de eiderscomuns (Somateria mollissima) e gansos de graylag(Anser anser) e descreveu como essas diferenças afetam tanto a capacidade coesa das penas quanto a capacidade das penas de prender o ar26. Os dados comparativos quantitativos sobre como essas variações nas penas afetam o desempenho térmico geral da camada de penas entre as espécies são limitados (para mais detalhes, consulte Taylor e Ward et al.) 11,13.
Dentro de uma espécie, o desempenho térmico do casaco de penas pode variar. Algumas espécies, como o periquito-monge(Myiopsitta monachus)17, habitam faixas geográficas muito grandes e diversas. As diferentes tensões térmicas colocadas por esses diferentes ambientes podem afetar as camadas de penas das aves dentro de uma espécie regionalmente, mas atualmente não há dados disponíveis sobre este tema. Além disso, Broggi et al. compararam duas populações de grandes tetas (Parus major L.) no hemisfério norte. Eles demonstraram que as penas de contorno da população mais ao norte eram mais densas, mas mais curtas e menos proporcionalmente depreciadas do que as da população mais sulista. No entanto, essas diferenças desapareceram quando aves de ambas as populações foram criadas no mesmo local18.
Além disso, Broggi et al. explicaram esses achados como uma resposta plástica às diferentes condições térmicas, mas não mediram os valores de isolamento desses diferentes casacos de penas18. Os resultados também sugerem que a densidade de penas de contorno é mais importante para o isolamento do que a proporção de farpas plumulaceous em penas de contorno, mas Broggi et al. sugeriram que as populações do norte podem ser incapazes de produzir penas ideais devido à falta de nutrientes adequados18. Medições quantitativas do desempenho térmico geral dessas camadas de penas aumentariam a compreensão da significância das diferenças de plumagem.
Com o tempo, as capas de penas de pássaros individuais variam. Pelo menos uma vez por ano, todas as aves molt (substituir todas as suas penas)19. Com o passar do ano, as penas passam a ser usadas2,20 e menos numerosas18,21,22,23. Alguns pássaros molt mais de uma vez por ano, dando-lhes vários casacos de penas distintas a cada ano19. Middleton mostrou que as goldfinchesamericanas (Spinus tristis),que se fundem duas vezes ao ano, têm um maior número de penas e maior proporção de penas caídas em sua plumagem básica nos meses de inverno do que em sua plumagem alternativa durante os meses de verão24. Essas diferenças anuais na camada de penas podem permitir que as aves economizem mais calor durante períodos mais frios passivamente ou derramem mais calor passivamente durante as estações quentes, mas nenhum estudo testou isso conclusivamente.
Embora as aves se subormem comportamentalmente1,27 e possam se aclimatar metabolicamente a diferentes condições térmicas3,4,5,6,7,8,9,10,26, as penas desempenham um papel importante na termoregulação, fornecendo uma camada constante de isolamento. O método descrito aqui é projetado para responder perguntas apenas sobre o casaco de penas e seu papel na termoregulação passiva (ou seja, quanto calor um pássaro vivo retém sem modificar seu comportamento ou metabolismo?) isolando as penas. Embora a termoregulação ativa e fisiológica seja ecologicamente importante, também é importante entender como as penas sozinhas auxiliam no isolamento e como influenciam a necessidade de termoregulação comportamental e fisiológica ativa.
Estudos anteriores estabeleceram métodos para quantificar a condutividade térmica e o isolamento térmico das peles de animais11,12,13,28. O método aqui apresentado é uma extensão do método "placa quente guardada"11,12,13,28. No entanto, o método descrito aqui mede a temperatura no limite externo do casaco de penas usando uma câmera térmica, em vez de termopares. O método de placa quente guardada dá estimativas muito precisas de fluxo de energia através de uma pele, mas requer a construção de uma placa quente multimaterial, alguma familiaridade com o uso de termoparles e termeléques, e uso destrutivo de uma pele que deve ser cortada em pequenos pedaços. Essas peças são então untadas para eliminar o ar entre a amostra e o aparelho de placa quente. Com exceção das poucas aves que não possuem apteria (por exemplo, pinguins), cortar pequenos quadrados de peles de aves é problemático para fins comparativos, uma vez que a localização do corte tem grandes efeitos sobre o número de penas realmente ligadas (e sobrelvando) a pele. Esse problema é agravado pela variação entre os impostos na presença, tamanho e colocação do ptyerlae14.
Além disso, enquanto os espécimes de museus podem ser um recurso potencialmente rico para avaliar a variação do isolamento entre as aves, em geral, a permissão para cortar e lubrificar espécimes de pele em coleções científicas é inatingível. Além disso, espécimes retirados da natureza para medições de placas quentes guardadas não podem ser posteriormente usados como espécimes de museu. O método aqui apresentado difere do método de placa quente guardada na medida em que pode ser usado com peles inteiras de aves secas, sem 1) exigindo a destruição do espécime e 2) lubrificando a parte inferior da pele. Ele usa câmeras térmicas, que são cada vez mais acessíveis (embora ainda relativamente caras), precisas e usadas para medições de aves vivas de relações térmicas.
Este método não mede o fluxo de energia (e, portanto, o valor de condutividade térmica ou isolamento) através da pele e das penas diretamente como o método de placa quente guardado. Em vez disso, mede a temperatura no limite externo de um casaco de penas usando uma câmera térmica. Os valores resultantes representam uma medida integrada do calor perdido passivamente através da pele, penas e ar preso entre eles (em comparação com uma fonte de calor por baixo). Os espécimes preparados como peles planas e medidos usando a técnica descrita podem ser armazenados em coleções e, indefinidamente, fornecem valor para futuras pesquisas. Este método fornece uma maneira padronizada, comparável e relativamente simples de medir o desempenho térmico do casaco de penas em qualquer espécime de pele plana, que é especialmente útil em comparações inter e intraespecíficas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>109000831</td>
			<td>30 square ft.; this exact model need not be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Core Board</td>
			<td>Foamular</td>
			<td>20WE</td>
			<td>1 in. x 4 ft. x 8 ft; this exact model need no be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Water Bath</td>
			<td>PolyScience</td>
			<td>WB02</td>
			<td>Ambiet +5 &#176;C to 100 &#176;C; &#177;.01 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF Data logger</td>
			<td>Elitech</td>
			<td>RC-51H</td>
			<td>Built in temperature and humidity sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass</td>
			<td>AdirOffice</td>
			<td>1212-3-C</td>
			<td>Acrylic glass; 12 in. x 12 in. x 1/8 in.; this exact model need not be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Image Analysis Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>ResearchIR Max v4.40.7.26 (64-bit)</td>
			<td>Allows collection of precise, quantitative thermal data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>SC655</td>
			<td>680x480-pixel resolution, &#177;2 &#176;C or &#177;2% accuracy, 40 cm minimum focusing distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td>The Audubon Shop</td>
			<td>The Birder Tripod with Manfrotto 700RC2 Rapid Release Head</td>
			<td>65&#34; maximum height; this exact model need not be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a thermal camera to measure heat loss through bird feather coats

As penas são essenciais para o isolamento e, portanto, para o custo da termoregulação, nas aves. Há literatura robusta sobre o custo energético da termoregulação em aves em uma variedade de circunstâncias ecológicas. No entanto, poucos estudos caracterizam a contribuição das penas apenas para a termoregulação. Vários estudos anteriores estabeleceram métodos para medir o valor de isolamento das peles de animais, mas exigem métodos de amostragem destrutivos que são problemáticos para as aves, cujas penas não são distribuídas uniformemente pela pele. Mais informações são necessárias sobre 1) como a contribuição das penas para a termoregulação varia tanto entre as espécies quanto dentro das espécies e 2) como os casacos de penas podem mudar ao longo do espaço e do tempo. Relatado aqui é um método para medir de forma rápida e direta o desempenho térmico de casacos de penas e a pele usando amostras secas de pele inteira, sem a necessidade de destruir o espécime da pele. Este método isola e mede o gradiente térmico através de uma camada de penas de forma que as medidas de perda de calor e custo metabólico em aves vivas, que usam estratégias comportamentais e fisiológicas para termoregular, não podem. O método emprega uma câmera térmica, que permite a rápida coleta de dados térmicos quantitativos para medir a perda de calor de uma fonte estável através da pele. Este protocolo pode ser facilmente aplicado a várias questões de pesquisa, é aplicável a qualquer taxa aviária, e não requer destruição do espécime da pele. Por fim, aprofundará a compreensão da importância da termoregulação passiva nas aves, simplificando e acelerando a coleta de dados quantitativos.

Os resultados representativos de uma série de um indivíduo de cada uma das cinco espécies, medidos a seis temperaturas, são apresentados na Figura 4 e Figura 5. Estes mostram que pequenas variações na colocação da pele podem resultar em variações nas leituras de até 1,7 °C. A Figura 4 mostra como o treinamento de um pesquisador aumenta a repetibilidade das medidas. Por exemplo, o mesmo pardal individual da casa (Pass...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats at JoVE.com

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Este protocolo descreve a quantificação da transmissão de calor através de um espécime aviário de pele plana usando uma câmera térmica e banho de água quente. O método permite a obtenção de dados quantitativos e comparativos sobre o desempenho térmico de casacos de penas entre espécies usando amostras secas de pele plana.

Usando uma câmera térmica para medir a perda de calor através de casacos de penas de pássaro

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...

using-a-thermal-camera-to-measure-heat-loss-through-bird-feather-coats

Research

JoVE Journal

Biology

3.4K visualizações.  University of Connecticut. Este protocolo descreve a quantificação da transmissão de calor através de um espécime aviário de pele plana usando uma câmera térmica e banho de água quente. O método permite a obtenção de dados quantitativos e comparativos sobre o desempenho térmico de casacos de penas entre espécies usando amostras secas de pele plana.

Vídeo: Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biologia

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

Rápida ciclagem térmica PCR usando convecção térmica em micro

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Em larga escala Knockdown Gene em<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...