Nosso protocolo é significativo porque permite que os pesquisadores investiguem o mecanismo molecular da angiogênese coronária fora de um organismo. A principal vantagem dessa técnica é que ela modela com precisão o processo de angiogênese coronária dentro de um organismo, facilitando o estudo dos mecanismos da angiogênese coronariana. Comece pulverizando um rato grávida carregando embriões embrionários de 11,5 dias com 70% de etanol.
Levantando a pele sobre a barriga com fórceps, use uma tesoura para fazer uma pele abdominal e incisão peritoneal lateralmente e anteriormente até o diafragma para expor o chifre uterino. Agarrando o útero, corte o tecido livre e puxe o chifre uterino. Coloque a sequência de embriões em PBS estéreis gelados sob um microscópio estéreo, e retire o músculo uterino, saco de gema e cobertura de amnion de cada embrião.
Como cada embrião é isolado, use uma colher perfurada para transferir os tecidos para uma nova placa de Petri contendo PBS estéril no gelo. Para colher o tecido cardíaco embrionário, transfira o primeiro embrião a ser dissecado em uma nova placa de Petri sob o microscópio, e coloque o embrião no lado ventral para cima. Use fórceps finos para fazer uma pequena incisão no peito, ligeiramente acima do diafragma, e insira os fórceps fechados na incisão para ampliar a incisão.
Usando os fórceps para manter a parede torácica aberta para expor o coração e os pulmões, use um segundo par de fórceps para mover suavemente o coração anteriormente 90 graus para expor a aorta dorsal e a veia. Em seguida, agarrando esses vasos na base do coração, puxe cuidadosamente o coração e os pulmões anteriormente e enxágue os tecidos com PBS frio. Quando todo o tecido cardíaco tiver sido colhido, coloque as amostras do coração sob o microscópio e remova os lóbulos pulmonares de cada coração.
Oriente o primeiro coração em seu lado dorsal, e segurando o coração em sua base, use fórceps finos para raspar a ária esquerda e direita no tecido adjacente ao redor do SV do coração. Para isolar o SV, oriente o lado dorsal do coração para cima. Remova cuidadosamente o SV do coração e use uma pipeta de transferência estéril para colocar o tecido isolado em uma nova placa de Petri de seis centímetros contendo PBS estéril gelado no gelo.
Para isolar todos os ventrículos, remova o trato de saída e use uma nova pipeta de transferência estéril para colocar os ventrículos em uma placa de Petri separada de seis centímetros contendo PBS estéril gelado no gelo. Para configurar culturas de SV e ventrículos inteiros, primeiro cubra as membranas de um poro de oito micrômetros de cultura PET inseridas por poço de uma placa de cultura de 24 poços, com 100 microliters de matriz extracelular recém-diluída por cultura por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius. Quando a matriz se solidificar, use uma pipeta de transferência para transferir uma explanta em cada inserção e mova a placa sob o microscópio.
Usando fórceps limpos, posicione as explanações no centro de cada inserção para garantir que elas não estejam presas às paredes laterais e remova cuidadosamente qualquer PBS extra. Em seguida, transfira a placa com a tampa fechada sob uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar, e adicione 100 microliters de meio completo pré-aquecido para cada inserção, e 200 microliters para o poço abaixo de cada inserção. Em seguida, adicione 300 microliters de PBS a quaisquer poços nãousados, e coloque a placa na incubadora de cultura celular por cinco dias.
Para o tratamento VEGF-A no segundo dia de cultura, remova o meio de ambas as câmaras de cada cultura e adicione 100 microliters de PBS a cada inserção, e 200 microliters de PBS a cada poço. Depois de rodar a placa algumas vezes, substitua o PBS por 300 microliters de meio basal suplementado com soro bovino 1% fetal para iniciar as culturas, e devolva a placa à incubadora. No terceiro dia após a fome, adicione 300 microliters de meio basal fresco mais soro aos poços de controle e meio basal mais 50 nanogramas por mililitro de VEGF-A aos poços de tratamento, e devolva a placa à incubadora de cultura celular.
No sexto dia de cultura, lave as câmaras com PBS como demonstrado, e fixe as culturas com 200 microliters de 4%paraformaldeído em cada poço, e 100 microliters de fixação em cada inserção. Depois de 20 minutos a 4 graus Celsius com balanço, lave as culturas com 300 microliters de PBS por 10 minutos por lavagem com balanço em temperatura ambiente. Após a última lavagem, adicione 300 microliters de solução de anticorpos primários aos poços e inserções para uma cultura noturna a quatro graus Celsius com balanço.
Na manhã seguinte, lave as culturas 10 vezes em surfactante não iônico na PBS com balanço, mudando a solução de lavagem a cada 10 minutos antes de rotular as culturas com 300 microliters de um anticorpo secundário fluoróvo apropriado conjugado a quatro graus Celsius durante a noite com balanço. No dia seguinte, lave as culturas 10 vezes em PBS fresco com surfactante não iônico como demonstrado. Após a última lavagem, use fórceps finos para descascar cuidadosamente a membrana de cada inserção e colocar as membranas em lâminas individuais de microscópio de vidro, explanta lateral para cima.
Cubra as amostras com meio de montagem suplementado da DAPI em um deslizamento de cobertura e sele as bordas dos deslizamentos da tampa com esmalte claro. Quando o esmalte secar, imagem os slides por microscopia confocal. À medida que as células SV iniciais crescem no ventrículo cardíaco, elas param de produzir marcadores venosos como o Coup-TF2.
Após cinco dias de cultura, as células endoteliais SV brotam e migram para a membrana. Como no coração embrionário, a expressão Coup-TF2 é reduzida à medida que os vasos migram para longe do SV. Culturas estimuladas com VEGF-A exibem um crescimento crescente de brotos angiogênicos tanto em densidade quanto em comprimento. Outras culturas de SV estimuladas pelo VEGF-A demonstram um aumento de quase três vezes no comprimento do broto em comparação com os controles, sugerindo que os brotos endoteliais de SV e endocardium respondem ao VEGF-A.
É importante não perder o tecido SV enquanto puxa o coração e os pulmões, removendo a atria e limpando o tecido adjacente ao redor do SV. Experimentos de imagem ao vivo podem ser realizados para visualizar a angiogênese coronária e capturar os detalhes da dinâmica celular e molecular durante o processo. Esta técnica é extremamente útil para avaliar potenciais mecanismos moleculares da angiogênese coronária e como um sistema modelo para estudar angiogênese em geral.
