그림 5의 면역블롯을 도와준 Yanyang Bai에게 감사의 말을 전합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research)[CRC-RS 950-232402 to AC]의 지원을 받았습니다. 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada) [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 to AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 to AC] 및 Brain Canada Foundation [AWD-023132 to AC]; 브리티시 컬럼비아 대학교 원주민 대학원 펠로우십 (6481에서 MT); 브리티시 컬럼비아 대학원 장학금(6768에서 MT); 캐나다 오픈 신경 과학 플랫폼 학생 학자 상 (10901 to JK); 브리티시 컬럼비아 대학교 4년제 박사 펠로우십(6569에서 JK). 연구비 지원자들은 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 출판 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다.

유세포분석을 사용한 마우스 뇌 히스톤 변형 정량화

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제시된 프로토콜은 유세포 분석을 통해 전체 HPTM 수준의 정량적 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 새로운 방법을 제시하지만, 이전 연구에서는 유사한 접근법을 사용하여 단백질의 정량적 평가를 수행했다26. HPTM의 전반적인 수준을 평가하기 위해 사용된 이전 방법에는 면역조직화학과 웨스턴 블롯 16,17,19,20이 포함됩니다. 제시된 유세포 분석 기반 분석법은 쉽게 정량화할 수 있는 방법인 반면, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학은 반정량적이며 처리량이 적습니다. 웨스턴 블롯은 세포 용해에 의존하며, 따라서 단백질 정규화와 실험 조건27에 의해 변하지 않는 것으로 가정되는 로딩 제어 단백질을 모두 필요로 한다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 반정량적이며 단일 세포 수준에서 검사하지 않고는 단백질의 양을 정량적으로 평가하기 어렵기 때문에 처리량이 매우 낮다(16). 유사하게, 분리된 미세아교세포의 경우, 웨스턴 블롯이 훨씬 더 큰 단백질 투입을 필요로 하기 때문에 제한된 수율로 인해 유세포 분석법을 사용하는 것이 이점이 있다19. 세포 수 요건이 적기 때문에 동일한 동물에서 여러 염색 패널을 실행할 수 있습니다.
그러나 다른 방법과 마찬가지로 이 기술에는 모든 항체가 유세포 분석 환경에서 잘 작동하는 것은 아니기 때문에 항체 비용 및 가용성을 포함한 제한 사항이 있습니다. 또한 면역블롯에 비해 필요한 항체의 농도가 훨씬 높습니다. 멀티플렉싱을 통해 동일한 세포 패널에서 여러 항체를 사용할 수 있지만 분석 후 세포에서 항체를 제거할 수 없으므로 세포 사용이 항체 종당 하나로 제한됩니다. 이것은 같은 블롯을 반복적으로 사용할 수 있는 면역블롯과는 다릅니다. 그러나 항체의 가용성과 세포분석기의 검출 채널 수에 따라 최대 12개의 마크를 동시에 검사할 수 있습니다.
현재 방법은 특정 게놈 위치가 아닌 단백질 발현의 글로벌 수준만 캡처하며, 글로벌 수준의 변화는 개별 게놈 위치의 변화를 반영하지 않을 수 있습니다. 마찬가지로, 전 지구적 수준의 변화가 없다는 것은 게놈 유전자좌가 변화하지 않는다는 것을 의미하지 않을 수 있으며, 단순히 전 지구적 변화가 치료법 간의 차이를 합치지 않는다는 것을 의미할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 게놈 분석을 위한 관심 HPTM을 식별하기 위한 스크리닝으로 사용됩니다. 또한, 이 방법은 대조군에 대한 접힘 변화로 평가되는 경우를 제외하고는 다른 단백질 마크에 대한 비교를 허용하지 않습니다. 따라서 이는 단백질 측정을 위한 ELISA와 같은 표준 곡선 기반 방법에 비해 제한적입니다.
제시된 프로토콜은 살아있는 뇌 미세아교세포를 분리하기 위한 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 미세아교세포 분리를 위해 P2RY12 단백질 발현에 의존합니다. 그러나 P2RY12는 미세아교세포의 항상성 마커이며 5XFAD22와 같은 질병 모델에서 하향 조절될 수 있습니다. 따라서 질병 모델 동물을 사용할 때는 미세아교세포(23)의 분리를 돕기 위해 TMEM119, CD11b 또는 CD45와 같은 다른 마커 단백질을 선택해야 합니다. 마찬가지로, 우리는 이 프로토콜을 해마 및/또는 피질로부터의 격리로 제시합니다. 이 프로토콜은 백질 영역을 포함한 다른 뇌 영역에서 미세아교세포를 분리하는 데 효과가 있지만, 관심 영역의 크기에 따라 충분한 미세아교세포를 얻기 위해 여러 동물이 필요할 수 있습니다.
제시된 프로토콜은 살아있는 뇌 미세아교세포를 강력하게 분리할 수 있지만, 잘못 수행할 경우 세포 수율을 감소시킬 수 있는 분리 단계에서 아래에 설명된 몇 가지 단계가 있습니다.
이 프로토콜에 대한 관류는 면역이 풍부한 단편에서 더 높은 비율의 미세아교세포를 발생시켜 분류기에서 시간을 단축합니다. 그러나 관류는 필요하지 않으며 필요한 경우 다른 안락사 방법을 사용할 수 있습니다.
미세아교세포를 분리하는 동안 미엘린은 완전히 제거되어야 합니다. 유세포 분석기는 세포가 좁은 튜브를 빠른 속도로 통과할 수 있어야 합니다. 점도와 응집되는 경향으로 인해 미엘린은 세포 분석기에 문제를 일으키며, 종종 막힘을 일으켜 장비를 손상시키고 샘플을 파괴하여 수율을 크게 감소시킬 수 있습니다. 다운스트림에서 문제가 발생하지 않도록 면역이 풍부한 단편을 수집하는 동안 모든 미엘린을 제거하는 데 주의하십시오.
플레이트 염색 대 튜브 염색: 이 프로토콜에서는 1.5mL 튜브 또는 96웰 플레이트에서 세포를 염색하는 두 가지 옵션을 설명했습니다. 각각의 사용 사례는 실험에 따라 다릅니다. 그러나 일반적으로 튜브 염색은 잘못 수행할 경우 세포가 손실될 위험이 있기 때문에 플레이트 염색보다 수율에 영향을 미칠 위험이 낮습니다. 플레이트 염색은 각 튜브의 상층액을 흡입하는 데 시간이 많이 걸리기 때문에 훨씬 빠릅니다. 고정(분류 등)하기 전에 튜브 염색을 사용하여 수율을 최대화하고 손실 위험을 줄이십시오. 그러나 HPTM 분석의 경우 핵 내 염색을 위해 세포를 고정하면 펠릿이 더 안정적이며 플릭으로 인한 손실 위험이 줄어듭니다.
불연속적인 밀도 구배 설정: 층을 설정할 때 면역 농축 분획을 얻으려면 층을 적절하게 설정하는 것이 필수적입니다. 층이 교란되거나 혼합되어 뿌옇게 보이면 세포가 원하는 위치로 분류되지 않고 면역이 풍부한 세포 분획을 얻는 데 어려움이 있습니다. 이 경우 밀도 배지로 회전시켜 미엘린을 제거한 다음 나머지 분획 전체를 수집하고 FACS 완충액 3mL로 밀도 배지 1mL로 희석한 다음 잘 혼합합니다(여러 개의 튜브가 필요함). 브레이크를 500으로 설정한 상태에서 10분 동안 0 x g 으로 회전합니다. 상층액을 버리고 ~300μL 용액만 남깁니다. 전체 샘플과 얼룩을 수집합니다. 이렇게 하면 분류 비율이 감소하고 세포분석기에서 더 많은 시간을 소비할 수 있지만 수율은 여전히 비슷할 수 있습니다.
분리 방법을 사용할 때 동일한 마우스 뇌에서 RNA 및 HPTM 평가를 위한 세포를 수집할 수 있는 것이 좋습니다. 이 상황에서, 살아있는 미세아교세포를 분류한 후, 세포를 나누어 RNA 평가에 일부를 할당하고(적절한 RNA 수율을 얻기 위한 최소 세포 투입 수는 75,000개임) 추가 유세포 분석 분석을 위한 부분(MFI의 양호한 측정을 위해 웰당 최소 10,000개 세포)을 할당할 수 있습니다. 이 경우 유세포 분석기 분류가 필요합니다. 그러나 HPTM 분석에만 세포를 사용할 계획인 경우 분류가 필요하지 않으며 면역 분획을 P2RY12 항체 및 HPTM 항체로 염색할 수 있습니다. 그런 다음 유동 분류와 마찬가지로 P2RY12+ 미세아교세포에 대해 유세포분석기의 게이팅을 설정하여 미세아교세포 내의 HPTM 신호만 분석할 수 있습니다. 정렬을 제거하면 프로토콜이 더 빠르고 비용 효율적일 수 있습니다. 또한 배양된 세포에서 HPTM을 평가하는 경우 염색 프로토콜에서 시작하는 것으로 충분하며 그림 6에 표시된 것처럼 세포 마커 항체가 필요하지 않습니다. HPTM 평가 프로토콜은 배양, 일차 세포 및 IPSC 유래 세포를 포함한 많은 세포 유형에 사용할 수 있습니다.
마지막으로, 미세아교세포의 두 가지 잠재적 용도를 제시했지만, ChIP, CUT&Tag 및 CUT&RUN과 같은 후성유전학적 기법을 포함한 다른 많은 용도가 있습니다. 특정 유전자좌의 변화를 특성화하는 것이 중요한 게놈 후성유전학 기법의 경우, 프로파일링된 미세아교세포 후성유전학적 변형이 효소 분해와 같은 분리 절차의 모든 단계에서 발생하는 기술적 인공물이 아닌지 확인하기 위해 실험에 맞춤화된 염색질 표시11 의 작성자 및 지우개에 대한 특정 억제제를 선택하십시오. 정량적 유세포 분석을 사용하는 것과 같이 후성유전학적 표지의 글로벌 수준의 변화를 평가할 때, 절차로 인한 변화는 글로벌 수준에서 검출될 정도로 크지 않을 것으로 예상됩니다.
전반적으로, 논의된 방법은 유세포 분석에 의한 히스톤 변형 및 기타 후성유전학적 변화의 글로벌 수준을 정량화하기 위한 새로운 단일 세포 방법을 제공합니다. 우리는 이 방법이 생체 내 LPS에 반응하여 미세아교세포에서 인핸서 마커 H3K27ac의 전반적인 변화를 검출할 수 있을 만큼 충분히 민감하다는 것을 입증했습니다. 이는 LPS28에 반응하는 인핸서의 극적인 리모델링을 보여주는 LPS 자극 후 H3K27ac의 이전 ChIP 시퀀싱과 일치합니다. 이 방법을 적용하면 발달 및 질병의 다양한 뇌 세포 유형에 걸쳐 전반적인 후성유전학적 변화를 조사할 수 있습니다.

후성유전학(Epigenetics)은 근본적인 DNA 염기서열을 변경하지 않고 유전자 발현을 조절하는 메커니즘에 대한 연구입니다. 유전자 발현의 후성유전학적 조절은 세포 내에서 역동적이며 다양한 환경 자극에 대해 신속하고 조정된 반응을 가능하게 할 수 있습니다. 동적 조절은 DNA1에 의해 단단히 감긴 옥타머 코어에 조립된 히스톤 단백질(H2A, H2B, H3, H4)로 구성된 뉴클레오솜 수준의 염색질 구조 변화로 인해 부분적으로 발생합니다. 히스톤 단백질과 DNA 사이의 상호 작용은 전사 기계에 대한 DNA의 접근성을 제어 할 수 있으며, 이는 궁극적으로 유전자 발현 및 염색질 생물학의 다른 측면을 제어 할 수 있습니다2. 히스톤 단백질은 음전하를 띤 DNA 골격과 정전기 상호작용을 형성하는 양전하를 띤 잔류물을 특징으로 하는 구조화되지 않은 꼬리를 가지고 있습니다. 이러한 상호 작용으로 인해 DNA가 단단히 포장되고 DNA 접근성이 감소합니다. 히스톤 후 번역 변형 (HPTM)이라고하는 히스톤 꼬리에 대한 공유 변형은 이러한 상호 작용을 조절 할 수 있습니다 3,4. 몇몇은의 잘 성격을 나타낸 HPTMS의 몇몇은, 히스톤 꼬리와 DNA 사이 정전기 상호 작용의 친화력을 변화시킬 수 있는 히스톤 꼬리 아세틸화와 메틸화를 포함해, 근본적인 DNA에 차별적인 접근가능성 및 특정한 위치에 이 HPTMs를 인식하는 전사 요인의 모집의 유래하. HPTMs는 효소의 3개의 중요한 종류에 의해 통제된다 인식하는 독자, 예금하는 작가 및 HPTMs를 제거하는 지우개- 불렸다. 따라서 판독기, 작가 또는 지우개 효소의 모집 또는 용해는 궁극적으로 HPTM의 지형을 변화시키고 염색질의 구조와 기능을 지배할 수 있으므로 세포 생물학 및 기능을 이해하는 데 필수적인 조절 및 판독이 될 수 있습니다 3,4.
중추신경계(CNS)의 세포는 환경 자극에 적응하기 위해 전사체를 변화시키기 때문에 후성유전학적으로 유연합니다. 축적된 증거에 따르면 DNA 메틸화, 비암호화 RNA, HPTM과 같은 후성유전체의 변화가 기억 형성과 시냅스 기능에 필수적인 역할을 한다5. 관련 독자, 작가 또는 지우개의 조작을 통해 HPTM 역학을 방해하면 연상 학습 및 장기 강화를 차단하거나 향상시킬 수 있습니다 6,7,8. 중추신경계의 상주 면역 세포인 미세아교세포는 후성유전체(epigenome) 9,10,11의 동적 변화를 통해 면역 자극에 반응하여 전사체를 빠르게 조절합니다. 미세아교세포의 후성유전체(epigenome)와 전사체(transcriptome)는 뇌 환경에서 제거된 후 배양 배지에서 단 몇 시간 만에 변화한다는 연구 결과가 있기 때문에 국소적 뇌 환경에 대한 이러한 높은 수준의 적응은 고립된 맥락에서 검사하기 어렵게 만든다11. 또한 미세아교세포는 뇌 세포의 10%만을 구성하기 때문에 전체 조직 수준에서 변화를 검사하는 측정은 민감도와 특이성이 부족합니다12,13. 결과적으로, 미세아교세포는 생체 외에서 HPTM 수준과 같은 후성유전학적 변화를 검사하기 위해 신속하게 분리되어야 합니다.
HPTM을 검사하는 데 일반적으로 사용되는 방법에는 염색질 면역침전 염기서열분석(ChIP-seq)과 표적 절단 및 태깅 염기서열분석(CUT&Tag-seq)이 있습니다4. 이러한 기술은 개별 HPTM에 매우 특이적이며 특정 게놈 컨텍스트 내에서 HPTM의 존재를 알릴 수 있지만, 단일 실험 내에서 가능한 많은 HPTM 중 하나만 검사할 수 있습니다11,14 따라서 상당한 시간과 비용 투자가 필요한 이러한 실험을 진행하기 전에 먼저 글로벌 변화를 조사하여 추가 조사를 위해 잠재적으로 흥미로운 HPTM 목록을 좁히는 것이 매우 중요합니다. HPTM 수준. 전체 HPTM 수준을 검사하기 위한 두 가지 주요 접근법은 면역조직화학과 웨스턴 블롯 분석이지만, 두 접근법 모두 반정량적이고 처리량이 적으며 많은 수의 조직 절편 또는 분리된 세포가 필요합니다15,16. 따라서 우리는 단일 세포 수준에서 글로벌 HPTM 수준을 신속하게 검사하는 데 사용할 수 있는 매우 민감하고 정량적인 방법을 개발하는 것을 목표로 했습니다.
제시된 프로토콜은 핵내 유세포 분석을 사용하여 글로벌 HPTM 수준을 신속하게 검출할 수 있습니다. 암세포에 대한 이전 연구는 임상적 관점에서 전 지구적 수준을 조사하는 것의 중요성을 정당화했다17,18. 또한 연구에서 관심 있는 특정 HPTM의 게놈 위치를 평가하기 전에 스크리닝 방법으로 글로벌 수준을 사용하는 것이 일반적입니다19,20. 미세아교세포의 경우, 낮은 세포 수율로 인해 분리 후 전체 수준을 평가하는 것은 어렵습니다. Pan 등은 분리된 미세아교세포의 전반적인 HPTM 수준을 제시하며, 여기서 3마리의 미세아교세포를 모아 웨스턴 블롯19에 의한 단백질 수준 검출을 가능하게 했습니다. 당사의 프로토콜을 사용하면 훨씬 적은 세포 입력으로 전반적인 변화를 감지할 수 있으므로 동물당 여러 마크를 스크리닝할 수 있고 샘플을 통합할 필요가 없습니다.
여기에서는 분리된 미세아교세포에서 정량적 핵내 유세포 분석을 통해 HPTM 수준을 신속하게 검출하는 프로토콜을 설명합니다. 간결함을 위해 HPTM 정량화에 특히 중점을 두지만, 이 프로토콜은 리더, 라이터 및 지우개 효소의 글로벌 수준을 정량화하는 데 동일한 방식으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 두 부분으로 나뉘는데, 첫째는 미세아교세포에 대한 분리 방법이고, 둘째는 HPTM 수준을 측정하기 위한 유세포 분석 기반 방법입니다. 분리 방법은 RNA 분리 및 HPTM 수준 평가 모두에 사용할 수 있는 세포를 생성하며, 이를 통해 동일한 샘플에서 유전자 발현 및 HPTM 수준을 평가할 수 있습니다. 또한, HPTM 평가 방법은 프로토콜에 표시된 다른 세포 유형에서 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Not Treated Plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>9649S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone H4 K8 (2594)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>2594S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8173S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA523516</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>15021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>2222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (tri methyl K4)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab213224</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM Biolabs</td>
			<td>PTM-1411RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb</td>
			<td>PRM Biolabs</td>
			<td>PTM-1401RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>848006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyto-Last Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, sterile</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>12611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-546-150</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS035</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>406410</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K18ac Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>720095</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM BIolabs</td>
			<td>PTM-1406RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>LK003178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC57004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptolide</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>97539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Nuclear Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>156604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of global histone post translational modifications using intranuclear flow cytometry in isolated mouse brain microglia

유전자 발현 조절은 히스톤 꼬리에 대한 번역 후 변형의 추가 및 제거를 포함하여 염색질 구조의 변형에 의해 부분적으로 발생합니다. 히스톤 번역 후 변형(HPTM)은 유전자 발현 또는 억제를 촉진할 수 있습니다. 예를 들어, 히스톤 꼬리 라이신 잔기의 아세틸화는 양전하를 중화하고 꼬리와 음전하를 띤 DNA 사이의 상호 작용을 감소시킵니다. 히스톤 꼬리-DNA 상호 작용의 감소는 기본 DNA의 접근성을 증가시켜 전사 인자 접근성을 증가시킵니다. 아세틸화 마크는 또한 브로모도메인 함유 전사 활성제의 인식 부위 역할을 하여 유전자 발현을 향상시킵니다. 히스톤 마크는 세포 분화 과정과 다양한 세포 환경 및 자극에 반응하여 동적으로 조절될 수 있습니다. 차세대 염기서열 분석 접근법은 개별 히스톤 변형에 대한 게놈 위치를 특성화하기 시작했지만 하나의 변형만 동시에 검사할 수 있습니다. 수백 가지의 서로 다른 HPTM이 있다는 점을 감안할 때, 우리는 보다 광범위한 게놈 시퀀싱 접근 방식을 수행하기 전에 히스톤 변형을 선별하는 데 사용할 수 있는 글로벌 HPTM의 높은 처리량, 정량적 측정을 개발했습니다. 이 프로토콜은 글로벌 HPTM을 검출하기 위한 유세포 분석 기반 방법을 설명하며 배양 중인 세포 또는 생체 내 조직에서 분리된 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다. 박테리아 유래 면역 자극(지질다당류)에 대한 반응으로 HPTM의 전역 이동을 감지하기 위한 분석의 민감도를 입증하기 위해 분리된 마우스 뇌 미세아교세포의 예제 데이터를 제시합니다. 이 프로토콜은 HPTM의 신속하고 정량적인 평가를 가능하게 하며 항체로 검출할 수 있는 모든 전사 또는 후성유전학적 조절자에 적용할 수 있습니다.

Epigenetics is the study of the mechanisms that regulate gene expression without altering the underlying DNA sequence. Epigenetic regulation of gene expression is dynamic within cells and can allow for rapid and coordinated responses to various environmental stimuli. The dynamic regulation occurs in part due to changes in the chromatin structure at the level of the nucleosome, which is comprised of histone proteins (H2A, H2B, H3, H4) assembled into an octamer core tightly wound by DNA1. The interactions between the histone proteins and the DNA can control the accessibility of DNA to transcription machinery, which can ultimately control gene expression and other aspects of chromatin biology2. Histone proteins have unstructured tails which feature positively charged residues that form electrostatic interactions with the negatively charged DNA backbone. These interactions result in tight packing of the DNA and reduced DNA accessibility. Covalent modifications to the histone tails, termed histone post-translational modifications (HPTMs), can regulate these interactions3,4. Some of the most well-characterized HPTMs include histone tail acetylation and methylation, which can change the affinity of electrostatic interactions between the histone tails and DNA, resulting in differential accessibility to the underlying DNA and recruitment of transcription factors which recognize these HPTMs at specific sites. HPTMs are regulated by three important classes of enzymes termed readers- which recognize, writers- which deposit, and erasers- which remove HPTMs. Thus, the recruitment or dissolution of reader, writer, or eraser enzymes can ultimately change the landscape of HPTMs and govern the structure and function of chromatin, making their regulation and readout essential for understanding cellular biology and function3,4.
The cells in the central nervous system (CNS) are epigenetically flexible as they change their transcriptome to adapt to environmental stimuli. Accumulating evidence suggests that changes in the epigenome, such as DNA methylation, non-coding RNAs, and HPTMs, play an essential role in memory formation and synaptic function5. Disrupting HPTM dynamics through manipulation of the relevant readers, writers, or erasers can block or enhance associative learning and long-term potentiation6,7,8. Microglia, the resident immune cell of the CNS, rapidly regulate their transcriptome in response to immune stimulation through dynamic changes in their epigenome9,10,11. This high level of adaptation to their local brain environment makes them difficult to examine in an isolated context as studies have shown that the epigenome and transcriptome of microglia becomes altered after only a few hours in culture media after removal from the brain environment11. In addition, as microglia only make up 10% of the brain&#39;s cells, measures examining changes at the whole tissue level lack sensitivity and specificity12,13. As a result, microglia need to be rapidly isolated to examine the epigenetic changes such as HPTM levels, ex vivo.
The methods commonly used to examine HPTMs include chromatin-immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) and cleavage under targets and tagmentation sequencing (CUT&#38;Tag-seq)4. While these techniques are highly specific to an individual HPTM and can inform the presence of HPTMs within a specific genomic context, they can only examine one of the many possible HPTMs within a single experiment11,14 Therefore, before proceeding with such experiments, which require a significant time and money investment, it is highly valuable to narrow down the list of potentially interesting HPTMs for further investigation by first examining changes in global levels of HPTMs. The two main approaches for examining global HPTM levels are immunohistochemistry and western blot analysis, but both approaches are only semi-quantitative, low-throughput, and require large numbers of tissue sections or isolated cells15,16. Thus, we aimed to develop a highly sensitive, quantitative method that could be used to examine the global HPTM levels rapidly and at the single cell level.
The protocol presented enables detection of global HPTM levels rapidly using intranuclear flow cytometry. Previous studies in cancer cells have justified the importance of examining global levels from a clinical perspective17,18. It is also common for studies to use global levels as a screening method prior to assessing genomic location of specific HPTMs of interest19,20. For microglia, assessing global levels following isolation is challenging due to the low cell yield; Pan et al present global HPTM levels from isolated microglia, in which microglia from three animals was pooled to enable protein level detection by western blot19. Using our protocol, we are able to detect global changes with much lower cell inputs, enabling screening of multiple marks per animal and eliminating the need to pool samples.
Here, we describe a protocol to detect HPTM levels rapidly via quantitative intranuclear flow cytometry in isolated microglia. While we focus specifically on HPTM quantification for the sake of brevity, this protocol can be used in the same way to quantify global levels of reader, writer, and eraser enzymes. The protocol is delivered in two parts: first, the isolation method for microglia and, second, the flow cytometry-based method for determining HPTM levels. The isolation method yields cells that can be used for both RNA isolation and HPTM level assessment which allows for the evaluation of gene expression and HPTM levels from the same sample. In addition, the method for HPTM assessment can be used on other cell types as indicated in the protocol.

저자 스포트라이트: 유전자 발현 조절 연구의 개선 사항

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

Our research aims to understand the fundamental regulatory mechanisms controlling gene expression in the brain, and we're particularly interested in understanding how disruption of these mechanisms contributes to neurodevelopmental and neuropsychiatric conditions. We focus on understanding how genetic and environmental risk factors combined to alter cellular function and produce behavioral impairments. This protocol includes methods for high-throughput screening of histone modifications in isolated microglia, allowing us to screen through dozens of different epigenetic modifications before committing to high-throughput sequencing, and functional follow-up studies.Our protocol provides measures of global histo modifications similar to Western plot. However, our technique is both faster, requires fewer input cells, is more quantitative, and can be multiplexed.

다 자란 마우스는 미세아교세포(microglia) 분리를 위해 경심(transcardially perfusion)되고 희생되었다. 미세아교세포를 얼음 상에서 분리하고, P2RY12-APC 및 보라색 525 살아있는 죽은 항체로 염색하였다. P2RY12에 대해 양성이고 보라색 525 살아있는 죽은 염색에 대해 음성으로 결정된 세포는 살아있는 미세아교세포로 분류되었습니다. 절개된 쥐의 뇌에서 나온 미세아교세포의 평균 수율은 1.28 x 105 ± 0.05(평균 ± 평균 표준 오차(SEM), N=100)이었다. 암컷(1.25 x 105 ± 0.09 [평균 ± SEM, N=46])과 수컷(1.32 x 105 ± 0.07 [평균 ± SEM, N=54]) 마우스(t(98)=0.6365, p=0.526)의 미세아교세포의 수율에는 차이가 없습니다. 특정 뇌 영역에서 분리했을 때, 쥐 피질에서 미세아교세포의 평균 수율은 8.3 x 104 ± 0.08(평균 ± SEM, N=15)이고 쥐 해마에서 4.1 x 104 ± 0.02(평균 ± SEM, N=16)입니다. 예상대로, 각 뇌 영역에서 미세아교세포의 수율에 유의한 차이가 있습니다(F(2, 128)=25.25, P<0.0001). 미세아교세포 분리 후, 저투입 RNA 분리 키트를 사용하여 분리된 세포에서 RNA를 추출했습니다. 일관되게 RNA 무결성 점수(RIN)는 9.0(9.62 ± 0.05) 이상이었고 세포당 RNA의 평균 수율은 0.25 ± 0.01pg(평균 ± SEM, N=32; 보충 파일 S2).
성체 마우스는 희생 24시간 전에 1mg/kg 지질다당류(LPS)를 복강내로 주사했습니다. 마우스는 HBSS로 심장 경관류되었고, 설명된 프로토콜에 따라 전체 뇌에서 미세아교세포를 분리했습니다(그림 5A). 각 염색에 대해, 20,000-30,000개의 세포가 각 항체 패널에 할당되었습니다. 히스톤 3 라이신 27 아세틸화(H3K27Ac)의 전반적인 수준은 유세포 분석을 통해 분리된 미세아교세포에서 평가되었습니다. 수컷 및 암컷 마우스의 경우, LPS 처리는 MFI가 성별 내에서 정규화될 때 H3K27Ac의 증가를 유도했습니다(t(6)=9.676, p<0.0001; 그림 5B). 염색된 세포에 대한 히스토그램을 검사할 때 모집단은 유사한 변동으로 정규 분포를 유지합니다. 그러나 세포는 형광 증가로 이동하여 MFI가 증가했습니다(그림 5C). 동일한 처리에서 H3K9Ac를 검사할 때 H3K9Ac도 유사한 증가가 있습니다(t(6)=7.299, p=0.0003; 그림 5D,E) 그러나 H3K9Ac 신호의 PBS에 대한 LPS의 접힘 변화는 H3K27Ac 신호보다 작습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> 그림 5: 분리된 미세아교세포에서 히스톤 아세틸화의 전반적인 변화. (A) 마우스는 희생 24시간 전에 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 1mg/kg 지질다당류(LPS)를 복강내로 주입합니다. 미세아교세포는 면역 농축 분획에서 수집되고 유세포 분석 및 전체 히스톤 번역 후 변형 평가를 위해 고정됩니다. 중간 형광 강도는 단백질 발현의 대용으로 평가됩니다. BioRender.com 로 만들었습니다. (B) LPS 치료에 대한 반응으로 H3K27Ac의 전반적인 수준이 증가했습니다. 실험과 성별 내에서 정규화된 PBS로의 폴드 변경. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정, t(6)=9.676, p<0.0001. 막대 그래프는 평균± SEM을 나타냅니다. N=8마리; 2개의 독립적인 실험에서 조건당 2개. (C) H3K27Ac 형광 강도의 이동을 묘사한 히스토그램의 예. 모달은 PBS 주입 마우스와 LPS 주입 마우스의 히스토그램을 나타냅니다. (D) H3K9Ac 형광 강도의 이동을 묘사한 히스토그램의 예. 모달은 PBS 주입 마우스와 LPS 주입 마우스의 히스토그램을 나타냅니다. (E) LPS 치료에 대한 반응으로 H3K9Ac의 전반적인 수준이 증가했습니다. 실험과 성별 내에서 정규화된 PBS로의 폴드 변경. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정, t(6)=7.299, p=0.0003. 막대 그래프는 평균± SEM을 나타냅니다. N=8마리; 2개의 독립적인 실험에서 조건당 2개. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
설명 된 방법이 이전에 사용 된 다른 히스톤 변형 정량화 방법과 비교할 수 있는지 확인하기 위해 면역 블롯을 비교 도구로 사용하는 것을 목표로했습니다. 그러나 분리된 미세아교세포의 수율은 합리적인 평가가 가능하기에는 너무 낮습니다. 따라서 배양된 BV2 세포를 사용하여 세포 내 유세포 분석법과 웨스턴 블롯(WB)을 비교했습니다. BV2 세포는 37°C, 5%CO2의 완전한 배지(DMEMF12, 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙타마이신 및 1x L-글루타민)에서 성장시켰다. 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 통과시키고 250,000 cells/well의 밀도로 도말하고 환원 혈청 배지(DMEM F12, 2% FBS, 1x 페니실린/스트렙타마이신 및 1x L-글루타민)에서 처리하고 37°C, 5%CO2에서 12시간 동안 회수하도록 했습니다. 세포는 상술한 바와 같이 고정하거나 WB 용해 완충액으로 용해하기 전에 24시간 동안 25ng/mL LPS로 처리하였다. H3K27Ac의 신호는 WB의 부하 제어로 GAPDH를 사용하여 두 가지 방법으로 수행되었습니다. PBS 대조군과 비교하여 정규화된 형광 강도를 분석한 결과, 각 그룹에 대해 결정하였다(그림 6A). WB에 의한 정규화된 H3K27Ac 신호의 변화를 조사할 때, 짝을 이루지 않은 t-검정(t=3.024, df=5; p=0.0293)에 의해 유의한 것으로 결정된H2O대조군에 비해 LPS 처리 조건이 1.527배 증가했습니다. 유세포 분석을 사용하여 변화를 조사했을 때 LPS 처리 조건이 1.482배 증가했으며 이는 유의한 것으로 확인되었습니다(t=7.843, df=10; p<0.0001). 2차 분산 분석을 사용하여 방법을 비교한 결과, 처리(F(1,15)=45.21,p<0.0001)에는 유의한 효과가 있는 것으로 확인되었지만 방법(F(1,15)=0.05545, p=0.8697) 또는 교호작용(F(1,15)=0.02785, p=0.8697)에는 유의한 효과가 없는 것으로 확인되었습니다. 또한, 2-way ANOVA는 LPS 처리(F(1,7)=0.02170,p=0.8870), 방법(F(1,7)=0.01191, p=0.9162) 또는 상호작용(F(1,7=0.01191, p=0.9162; 그림 6B). 이 데이터에 대한 블롯 및 히스토그램 이동의 예도 나와 있습니다(그림 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> 그림 6: 유세포 분석법과 웨스턴 블롯 간의 글로벌 히스톤 변형 변화를 정량화하기 위한 방법 비교. (A) BV2 세포는 분석 전에 25ng/mL 지질다당류(LPS) 또는H2O로 24시간 동안 처리됩니다. H3K27Ac의 형광 강도는 유세포 분석 및 웨스턴 블롯 모두에 대해 차량 제어, 인산염 완충 식염수(PBS)의 접힘 변화로 표시됩니다. 2원 분산 분석에서는 LPS 처리(F(1,15)=45.21, p<0.0001)의 유의한 효과가 나타났지만, 방법(F(1,15)=0.05545, p=0.8697) 또는 교호작용(F(1,15)=0.02785, p=0.8697)은 유의하지 않았습니다. 다중 가설 검정에 대한 Tukey의 수정이 잔차에 적용되었습니다. *는 0.0332를 나타내고, **는 0.0021을 나타냅니다. (B) 히스톤 H3의 형광 강도는 유세포 분석 및 웨스턴 블롯 모두에 대해 PBS로의 접힘 변화로 표시됩니다. 2원 분산 분석에서는 LPS 처리(F(1,7)=0.02170, p=0.8870) 또는 방법(F(1,7)=0.01191, p=0.9162) 또는 교호작용(F(1,7=0.01191, p=0.9162)에서 유의한 효과가 나타나지 않았습니다. (C) 블롯 및 (D) 유세포 분석 이동이 묘사되어 있습니다. 히스토그램 크기는 형광 강도 모드에 존재하는 셀 수를 기준으로 백분율로 정규화됩니다. 막대 그래프는 평균 SEM을 나타냅니다. n=2개의 독립 실험, 실험당 조건당 2개. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이러한 결과는 이 기법이 분리된 미세아교세포의 전체 HPTM 수준을 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 또한, 이 방법은 이전 기술과 비슷하지만 훨씬 더 낮은 셀 입력을 필요로 하는 것으로 나타났습니다. 또한, 도시되지는 않았지만, 적절한 보상과 함께, 본 기술은 상이한 HPTM을 평가하는 동일한 패널 상의 다수의 항체와 함께 사용될 수 있다.
보충 파일 S1: 예제 분석 파일. 이 파일에는 wsp 분석 파일과 얼룩이 없는 P2RY12FMO, 568FMO, PBS 처리 동물 2마리 및 H3K27Ac로 염색된 LPS 처리 동물 2마리를 포함한 7개의 fcs 파일이 포함되어 있습니다. 이 파일의 목적은 성공적인 실험이 어떻게 생겼는지 묘사할 수 있는 실험에 대한 분석 및 게이팅을 보여 주는 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 S2: 격리 데이터. 포함된 파일에는 설명된 프로토콜의 미세아교세포 및 RNA 수율을 포함하는 관련 데이터 포스트 미세아교세포가 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>게이티드 모집단(GATED POPULATION)</td>
			<td>부모의 빈도</td>
			<td>합계의 빈도</td>
			<td>세다</td>
		</tr><tr><td>시즌 1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>시즌 2> 시즌 1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ > S2 > S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ > APC+ > S2 > S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 샘플 계통 차트의 예는 정확한 단백질 검출에 필요한 백분율 및 사건 수를 보여줍니다.

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이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

우리의 연구는 뇌에서 유전자 발현을 조절하는 근본적인 조절 메커니즘을 이해하는 것을 목표로 하며, 특히 이러한 메커니즘의 파괴가 신경 발달 및 신경 정신 질환에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 우리는 유전적 및 환경적 위험 요인이 어떻게 결합되어 세포 기능을 변화시키고 행동 장애를 일으키는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜에는 고립된 미세아교세포에서 히스톤 변형의 고처리량 스크리닝 방법이 포함되어 있어 고처리량 시퀀싱 및 기능적 후속 연구에 전념하기 전에 수십 가지의 서로 다른 후성유전학적 변형을 스크리닝할 수 있습니다.우리의 프로토콜은 서구 플롯과 유사한 글로벌 히스토 수정의 척도를 제공합니다. 그러나 우리의 기술은 더 빠르고, 더 적은 입력 셀이 필요하며, 더 정량적이고, 다중화될 수 있습니다.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

622 조회수.  University of British Columbia. 우리의 연구는 뇌에서 유전자 발현을 조절하는 근본적인 조절 메커니즘을 이해하는 것을 목표로 하며, 특히 이러한 메커니즘의 파괴가 신경 발달 및 신경 정신 질환에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 우리는 유전적 및 환경적 위험 요인이 어떻게 결합되어 세포 기능을 변화시키고 행동 장애를 일으키는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜에는 고립?...