Este trabalho foi apoiado pelo Labex MemoLife e pelo ARSEP (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en placas)

1. Soluções e Materiais <ol><li> Preparar soluções de vasos isolamento: B1, adicionar 1,5 mL de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, adicionar 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, adicionar 1 g de BSA para 100 ml de B1. </li><li> Modificar o suporte do filtro cortando o fundo fora da parte superior de enroscar. </li><li> Preparar soluções de positividade: solução de fixação, paraformaldeído a 4% em PBS pH 7,4; Permeabilização / solução de bloqueio, soro de cabra diluído a 5% e Triton X100 a 0,25% em PBS pH 7,4. Nota: Fixação depende do tipo de anticorpos primários usados. </li></ol> 2. Dissecção Nota: As condições estéreis não são requeridos, a menos que os navios são usados ​​para fins de cultura de células. <ol><li> Prepara-se uma proveta de 150 ml com 20 ml de B1. Manter em gelo e cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar. </li><li> Profundamente anestesiar o mouse sob um capuz com uma pequena toalha de papel embebido em 1 ml de isoflurano pura que é adicionado into da gaiola. A anestesia é verificada pela ausência de reacção com uma pitada do dedo do pé. Matar o rato por deslocamento cervical. NOTA: Estes passos são realizados em conformidade com os regulamentos nacionais e institucionais. </li><li> Opcional: realização de perfusão intracardíaca com 20 ml de PBS 1x para eliminar o teor de sangue 24. </li><li> Seção da pele com um bisturi do pescoço até o nariz e puxe-o para longe. Remove todos os cabelos contaminantes com PBS 1x. </li><li> Para abrir o crânio, insira primeiro tesoura anteriormente ao bulbo olfatório, e abrir a tesoura para romper o crânio em duas partes. </li><li> Retire cuidadosamente o cérebro usando uma espátula cérebro. Dissecar o plexo coróide dos ventrículos laterais, pois iria contaminar a preparação do vaso sanguíneo 38. NOTA: Opcional: A preparação final conterá parênquima e vasos meninges. Se não for desejado, meninges pode ser removida seguindo o procedimento descrito por 38. </li><li> Transfer o cérebro em o copo contendo solução B1 no gelo. Até 8 cérebros pode ser tratado em conjunto. </li></ol> 3. A homogeneização do tecido cerebral <ol><li> Usando dois bisturis, manualmente e vigorosamente bateu o cérebro na solução B1, posteriormente, obter pequenos pedaços de cerca de 2 mm. </li><li> Homogeneizar a preparação com um homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 passagens a 400 rpm. Assegure-se que o tubo de vidro é mantido em gelo e que a parte superior do douncer está em solução quando se deslocam para baixo e para cima, de modo a evitar a formação de bolsas de ar. Se várias amostras são preparadas, lavar a douncer com água ionizada entre cada homogeneização. </li></ol> 4. Purificação Vessel <ol><li> Transferir o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 ml e proceder à centrifugação a 2000 g durante 10 min a 4 ° C. Um grande interface de branco (na maior parte da mielina) irá formar na parte superior do vaso de pelete (vermelho, se não de perfusão foi realizada). </li><li> Desprezar o sobrenadante. O sedimento navio e da interface branca irá permanecer solidários juntos. Adicionar 20 ml de solução B2 gelada e agitar o tubo manualmente e vigorosamente durante 1 min. </li><li> Proceda à segunda centrifugação a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. A mielina irá agora formar uma camada branca densa na superfície do sobrenadante. </li><li> Retirar cuidadosamente a camada de mielina de as paredes do tubo, segurando o tubo e rodando-a lentamente para permitir que o sobrenadante a passar ao longo das paredes. Descartar o sobrenadante com mielina. O sedimento contendo os vasos permanece presa na parte inferior do tubo. </li><li> Seque a parede interior do tubo com um papel absorvente enrolada em torno de uma pipeta de plástico de 5 ml e remover todos os fluidos residuais, evitar tocar o sedimento navio. Manter o tubo de cabeça para baixo sobre um papel absorvente para drenar o líquido remanescente. </li><li> Suspender o sedimento em 1 ml de solução B3 gelada por pipetagem cima e para baixo com dicas de baixa ligação, keeping o tubo em gelo, em seguida, adicionar mais 5 ml de solução B3. Certifique-se de que os navios são dispersas, tanto quanto possível e não formam agregados. </li></ol> 5. Filtration <ol><li> Prepara-se uma proveta em gelo com 30 ml de solução B3 gelada. Cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar. </li><li> Colocar um filtro de malha 20 uM sobre um suporte de filtro modificado na parte superior de um frasco de Becker e equilibrar através da aplicação de 10 ml de solução B3 gelada. </li><li> Verter a preparação navio no filtro e lavar os vasos com 40 ml de solução B3 gelada. </li><li> Recuperar o filtro usando uma pinça limpa e mergulhe-o imediatamente no copo contendo a solução B3. Retire os navios do filtro sacudindo-o suavemente. </li><li> Verter o conteúdo do copo num tubo de plástico de 50 ml e centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Nota: Como alternativa, a suspensão dos vasos cerebrais &#39;a partir do passo 4.6 pode ser filtrado sobre um filtro de malha 100 micrometros de.Neste caso, navios maiores são preferencialmente retidos no filtro enquanto o fluxo através contém principalmente microvasos (capilares), que são, em seguida, filtrada através de um filtro de 20 fim mesh como acima. </li><li> Ressuspender o sedimento de microvasos em 1 ml de solução B3 gelada e transferi-lo, pipetando-o para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 6. Fixação, permeabilização e bloqueio <ol><li> Vasos de transferência por pipetagem em tubos de PCR de 0,2 ml contendo PBS usando um 1,0 ml baixa ponta de ligação. Tenha cuidado para não tocar os vasos, pois podem aderir à parte exterior da ponta. Executar todas as etapas a seguir em um microscópio binocular. </li><li> Para cada um dos seguintes mudanças de meio, deixar os tubos em gelo até os vasos ter atingido o fundo, e pipetar a maior parte dos líquidos usando longos e coisa gel de carregamento de pontas de pipeta. </li><li> Remover a maior parte do PBS e adicionar 200 ul de solução fixadora.Suspender os vasos agitando suavemente e incuba-se durante 20 min à TA. </li><li> Pipeta a solução fixadora e substituí-la por 200 mL de 1x PBS (primeira lavagem), incubar durante 5 min a RT e repita esta etapa 3 vezes. Cada vez, verificar que os navios tenham correctamente depositada no fundo dos tubos e pipeta fora 1x PBS, garantindo os vasos não são tocados. </li><li> Após a última lavagem, substitua por PBS 1x / solução de permeabilização de bloqueio e incubar 1 hora à TA, ressuspensão dos vasos, agitando suavemente ao longo do tempo. </li></ol> 7. Immunostaining <ol><li> Substitua o / bloqueio solução de permeabilização com a mistura de anticorpos primários (ver referências dos anticorpos usados ​​aqui e diluições na tabela modelo de Materiais) diluído na / solução de bloqueio permeabilização, e incubar a 4 ° CO / N. </li><li> Após 3 lavagens em PBS, à TA, incubar os vasos com a mistura de anticorpos secundários diluído em PBS durante 2 hà TA. </li><li> Nota: recomendamos a realização de coloração nuclear com Hoechst (1: 2.000) ou DAPI (1: 2.000), a fim de distinguir os navios de possíveis contaminantes cabelos ou poeiras sob o microscópio. </li><li> Após 3 lavagens em PBS, ressuspender os vasos em 50 ul de PBS. </li></ol> 8. Montagem e Observação <ol><li> Prepare uma ponta com um capilar de vidro siliconizada: cortar uma ponta de pipeta P200 utilizando um bisturi e ajustar o capilar no interior. O volume aproximado do tubo capilar é de 40 ul. </li><li> Transferir os recipientes para uma lâmina de vidro usando o capilar de vidro siliconizada e cuidadosamente remover o líquido com um pedaço de papel absorvente. </li><li> Aplicar uma única gota de meio de montagem para os navios e mantenha uma lamela a 45º permitindo que a gota espalhar-se ao longo da borda do deslizamento. Vamos sair da lamela e permitir meio para espalhar lentamente. Deixá-lo seco O / N à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Os navios podem ser observados sob uma fluoresmicroscópio confocal ent. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A barreira sangue-cérebro regula a passagem de substâncias fisiológicas dentro e fora do sistema nervoso central e o protege contra substâncias potencialmente nocivas presentes no sangue. Ele está envolvido em várias patologias do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas 2 e tumores cerebrais 28. A baixíssima permeabilidade da certificação também dificulta a passagem de agentes terapêuticos que visam células neurais e ao desenvolvimento de métodos que pretendem abrir reversível a ce...

O funcionamento adequado do sistema nervoso central (SNC) requer um ambiente extracelular altamente regulada, e as demandas metabólicas são enormes em comparação com outros órgãos 1. O SNC também é extremamente sensível a uma vasta gama de produtos químicos, geralmente inofensivo para órgãos periféricos, mas a ela, neurotóxica. Para assegurar um funcionamento correcto, a maior parte do &quot;vasculatura SNC forma uma barreira endotelial; a barreira sangue-cérebro (BBB), que controla o fluxo de moléculas e iões, bem como a passagem de células do sistema imunológico entre o sangue e o cérebro, mantendo assim a homeostase devida 2, mas também limitar a entrada de drogas terapêuticas, os tratamentos que impedem assim de distúrbios neurológicos 3. Ao nível celular, a certificação é sustentada principalmente por extensos junções apertadas entre as células endoteliais, expressão polarizada de transportadores de efluxo e uma taxa muito baixa transcitose 4. Propriedades e as funções da certificação são principalmente induzida por NEcélulas ighboring 4. Em particular, pericitos desempenhar um papel importante na indução e manutenção da certificação 5,6. Sendo células contrácteis, pericitos também regular o fluxo sanguíneo como fazem os 7 células de músculo liso circundantes grandes vasos. Finalmente, astrócitos, as principais células gliais do cérebro, enviar grandes processos chamados endfeet em torno da maioria da vasculatura cerebral 8 e modula a certificação integridade e quiescência imune 9, a transferência de metabolitos para neurónios de 10, e induzir o acoplamento apertado entre a actividade neuronal e o fluxo de sangue 11,12. A capacidade para estudar as propriedades moleculares e celulares do sistema vascular cerebral é crucial para caracterizar melhor a sua contribuição para a fisiologia do cérebro e fisiopatologia. Para fazer face a esta questão, as estratégias para isolar sistema vascular cerebral do cérebro têm sido desenvolvidos, que permitem a preparação de fragmentos de vasos cerebrais intactas. Cerebral navio purification foi inicialmente descrita usando cérebros de bovinos 13 e melhorado e adaptado para outras espécies, em particular roedores 14. Neste último estudo, a utilização de filtros de tamanho variável foi introduzido para separar vasos cerebrais em fracções enriquecidas em recipientes de diferentes diâmetros. Curiosamente, em tais preparações, as células endoteliais mantiveram suas propriedades metabólicas 15, funcionalidade transportador 16 e 17 de polarização. Aqui, descrevemos detalhadamente este protocolo e ainda demonstrar que os navios isolados reter a maior parte de seu em estruturas in situ. As células endoteliais permanecem ligados por junções apertadas e rodeado por uma lâmina basal contínua. Pericitos e células musculares lisas permanecem ligadas à camada endotelial, bem como as membranas de astrócitos perivasculares. No entanto, astrócitos, células microgliais, neurónios e os oligodendrócitos são eliminados. Finalmente, descreve-se um procedimento para executar imunocoloração em vasos cerebrais isoladas. </p&gt; Até agora a maioria dos estudos moleculares e celulares relacionadas com o sistema cerebrovascular foram realizados em células dos vasos cerebrais purificados dissociadas utilizando estirpes repórter do mouse específicos de células ou procedimentos baseados imunocoloração 18,19 classificando-célula. Embora estas técnicas permite o isolamento de populações de células vasculares cerebrais quase puros, células isoladas perder completamente a sua morfologia in situ e interacções, que por sua vez, afecta grandemente as suas propriedades moleculares e celulares. O protocolo aqui descrito, permitindo o isolamento de fragmentos cerebrovasculares inteiras sem a necessidade de anticorpos específicos ou manchas de ratinhos transgénicos, oferece uma boa alternativa, a estrutura global dos vasos cerebrais isoladas é conservada, assim, diminuir repercussões sobre as suas propriedades moleculares. Isolado navios poderiam, então, ser usado para estudar a atividade do gene, a síntese de proteínas e regulação no BBB, como recentemente descrita 20,21 </sup&gt;. Finalmente, em relação ao laser captura microdissection 22,23 o presente protocolo é barato, fácil de executar e rapidamente adaptável em qualquer laboratório.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

No cérebro, a maior parte do sistema vascular consiste de uma barreira selectiva, a barreira sangue-cérebro (BBB) ​​que regula a permuta de moléculas e células do sistema imunológico entre o cérebro e o sangue. Além disso, a enorme demanda metabólica neuronal requer um regulamento momento-a-momento de fluxo sanguíneo. Notavelmente, anormalidades destes regulamentos são características etiológicos da maioria das patologias cerebrais; incluindo o glioblastoma, acidente vascular cerebral, edema, epilepsia, doenças degenerativas (ex: doença de Parkinson, doença de Alzheimer), tumores cerebrais, bem como das condições inflamatórias tais como esclerose múltipla, meningite e disfunções cerebrais induzidas por sepsia. Assim, a compreensão dos eventos de sinalização que modulam a fisiologia vascular cerebral é um grande desafio. Muito conhecimento sobre as propriedades moleculares e celulares de vários tipos de células que compõem o sistema vascular cerebral pode ser adquirida a partir da cultura primária ou separação de células a partir de tecido cerebral dissociado recentemente. Contudo,Propriedades tais como polaridade celular, a morfologia e as relações intercelulares não são mantidos em tais preparações. O protocolo que se descrevem aqui é concebido para purificar fragmentos dos vasos do cérebro, ao mesmo tempo manter a integridade estrutural. Mostra-se que os vasos isolados são constituídos por células endoteliais seladas por junções apertadas, que são rodeadas por uma lâmina basal contínua. Pericitos, células musculares lisas, bem como as membranas de astrócitos endfeet perivasculares permanecem ligados à camada endotelial. Finalmente, nós descrevemos como a realização de experimentos de positividade em vasos cerebrais purificados.

Aqui, descrevemos um protocolo permitindo o isolamento mecânica dos vasos cerebrais 14. Figura 1 resume as principais etapas desta técnica. A arquitetura dos vasos cerebrais é complexa e inclui vários tipos de células, isto é, células endoteliais seladas por junções apertadas e pericitos, rodeados por células de músculo liso, e os processos de astrócitos do pé 9. Assim, após o isolamento dos vasos cerebrais, que teve como objetivo caracterizar a estrutura dos...

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Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K visualizações.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

Vídeo: Purification of Mouse Brain Vessels

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

Purificação de Prominin-1+ Células-tronco do Rato Pós-Natal Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol describes in vivo labeling and subsequent purification of newly synthesized proteins using an engineered mouse line to direct protein labeling to specific cellular populations. It is an inducible line by Cre recombinase expression of L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), enabling azidonorleucine (ANL) incorporation to the proteins, which otherwise will not occur. Using the method described here, it is possible to purify cell-type-specific proteomes labeled in vivo and detect subtle changes in protein content due to sample complexity reduction.

This protocol describes how to perform cell-type-specific protein labeling with azidonorleucine (ANL) using a mouse line expressing a mutant L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*) and the necessary steps for labeled cell-type-specific proteins isolation. We outline two possible ANL administration routes in live mice by (1) drinking water and (2) intraperitoneal injections.

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase