Os arranjos de nanofibras foram fabricados no Center for Nanophase Materials Sciences, que é um Centro de Instalações do Usuário do Departamento de Energia (ID da Proposta: CNMS2019-103 e CNMS2022-A-1182). O apoio da CNMS é concedido por meio de um sistema de propostas revisadas por pares e é fornecido gratuitamente aos candidatos aprovados que pretendem publicar seus resultados (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Agradecemos a Kevin Lester e à CNMS pela assistência na produção de matrizes de nanofibras. Agradecemos ao Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs e Travis Bee pelas discussões críticas sobre design experimental. Agradecemos ao Dr. Adam Rondinone pelo esquema da máquina PECVD. Agradecemos a Leslie Carol pelas ilustrações científicas. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Ciência de Bioimagem, Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Pesquisa Biológica e Ambiental, DE-SC0019104, e Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, 2021-67013-34835. A JMM foi apoiada pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.

1. Produção de VACNFs (Figura 2 e Figura 3)
<ol><li>Spincoat um wafer de silício com polimetilmetacrilato (PMMA) 495 A4 resiste a 4000 rpm e assar a 180 °C por 5 min. NOTA: Deixe o wafer esfriar por 10 s antes de prosseguir para a próxima etapa.</li>
	<li>Espinar uma segunda camada de resiste (PMMA 950 A2) e assar a 180 °C por 5 min.</li>
	<li>Use a litografia por feixe de elétrons para definir os pontos catalisadores com diâmetros de 300 nm em um espaçamento lateral especificado (pitch: 10 μm ou 35 μm) em matrizes de 3 mm x 3 mm.</li>
	<li>Desenvolver o resiste em 30-40 mL de metil-isobutilcetona 1:3: álcool isopropílico (IPA) por 1,5 min, seguido de enxaguar com IPA e secá-lo com N2. NOTA: Verifique a matriz de pontos usando um microscópio de campo brilhante (objetiva de 20x).</li>
	<li>Limpe o wafer do resiste residual com uma exposição de 6 s em plasma de oxigênio (descum) em um condicionador de silício.</li>
	<li>Use a evaporação do feixe de elétrons para depositar primeiro uma camada adesiva de metal (Ti ou Cr, 10 nm) e depois depositar uma segunda camada, que é o catalisador de Ni (130 nm ou 150 nm). Durante a deposição de metal Ti ou Ni, mantenha a corrente abaixo de 0,2 A em 10 kV, a pressão abaixo de 5 x 10-6 Torr e a taxa de deposição em ~1 A/s para deposição de linha de visão.</li>
	<li>Use sonicação de banho sequencial para remover o metal (Ni) depositado na camada de resistência subjacente, deixando o Ni depositado diretamente sobre o wafer de silício. Esse processo é chamado de decolagem.<ol><li>Para isso, prepare 3 recipientes com acetona e banho sonicate o wafer em acetona por 1 min; repetir 3 vezes à temperatura ambiente (RT, 20 °C) a uma frequência de 35 kHz. Enxágue com IPA e seque com N2. OBS: Nunca deixe a acetona secar na bolacha. Após a última sonicação da acetona, enxaguar imediatamente com IPA e secar com gás N2 . Se em algum momento o wafer ficar prematuro seco (antes do enxágue IPA) existe a possibilidade de que nem todo o excesso de metal e resistência seja removido e a acetona possa deixar um resíduo.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique a geometria da forma do catalisador usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para capturar imagens SEM dos chips VACNF, incline o palco para um ângulo de 30° e use uma tensão de 1-3 kV, com uma corrente de feixe de ~100 pA e uma distância de trabalho de ~5 mm. NOTA: O catalisador deve se parecer com um puck de hóquei (um cilindro compacto) (Figura 4). A altura do cilindro compacto deve refletir a espessura do Ni depositado no wafer de silício. Se o perfil do ponto Ni é alto e parece ser côncavo no topo, assemelhando-se a um vulcão (Figura 4), então o catalisador tem maior probabilidade de desmolhar em múltiplas gotículas de Ni, resultando na ramificação das nanofibras de carbono9 (Figura 4 e Figura 5). Tais problemas podem resultar da resistência à fusão durante a evaporação do metal devido a longos tempos de deposição ou problemas com o procedimento de decolagem (Figura 4 e Figura 5).</li>
	<li>Triturar o wafer de silício e colocá-lo na câmara de deposição química de vapor reforçada por plasma de corrente contínua (dc-PECVD) com a mistura acetileno/amônia. Otimizar os parâmetros de crescimento para controlar o comprimento e a conicidade das nanofibras (pontas <200 nm).<ol><li>Use uma corrente de 1-1,5 A e uma faixa de tensão de 440-560 V. Ao cultivar as fibras, use uma fase de pré-tratamento com fluxo de amônia enquanto a máquina e o substrato aquecem até 620 °C. Certifique-se de ligar a fonte de carbono (acetileno) 10 s antes de iniciar o plasma. NOTA: Os wafers quarto são usados caso os parâmetros de execução da máquina PECVD precisem ser otimizados. Para produzir fibras com comprimento superior a 40 μm e pontas inferiores a 200 nm de diâmetro, sugerem-se os seguintes parâmetros: com espessura de catalisador de Ni de 130 nm, utilizar corrente de 1,75 A, tempo de crescimento de 70 min e relação acetileno: amônia de 45 centímetros cúbicos padrão por minuto (sccm): 100 sccm. Com uma espessura de Ni de 150 nm, use uma corrente de 1,5 A, um tempo de crescimento de 80 min, e uma relação acetileno: amônia de 48 sccm: 100 sccm. Use os seguintes parâmetros para cultivar VACNFs, independentemente da espessura do catalisador: temperatura de crescimento de 620 °C, pressão de 10 torr durante o plasma e altura do chuveiro de 20 mm (Figura 6).</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliar a geometria das fibras resultantes usando MEV a uma inclinação de 30° com um potencial de aceleração de 1 kV. NOTA: As fibras ideais serão retas e não ramificadas. É impossível controlar a orientação cristalina do catalisador de Ni com o evaporador de feixe de elétrons. Como resultado, haverá algumas fibras que se ramificam por causa da desumectação do catalisador9. Além disso, a orientação do cristal faz com que os VACNFs cresçam a alturas diferentes, de modo que alturas uniformes em todos os VACNFs são difíceis.</li>
	<li>Spincoat uma camada de fotorresiste (SPR955) sobre as fibras a 1000 rpm por 45 s. Em seguida, corte o wafer de 1/4 em matrizes de 3 mm x 3 mm usando uma serra de cubos. Armazene as fibras neste ponto para uso posterior. NOTA: Não execute a etapa 1.11 se estiver planejando transferir fibras para um substrato flexível.</li>
</ol>2. Ttransferindo VACNFs para um substrato flexível (Figura 7 e Figura 8)
<ol><li>Depois que as fibras são sintetizadas, o spincoat SU-8 2015 fotorresiste nos wafers ou wafers a 4000 rpm por 45 s.</li>
	<li>Asse o wafer por 3 min a 95 °C.</li>
	<li>Usando um alinhador de contato, exponha o wafer com uma máscara padronizada de matriz de 3 mm de 3 mm que se alinha com o padrão definido da litografia por feixe de elétrons a 95 mJ/cm2. NOTA: Use um modo de contato de proximidade com um intervalo de exposição que é 20 μm maior do que a fibra mais alta. Existe a possibilidade de que as fibras possam ser derrubadas durante essa etapa do processo.</li>
	<li>Levar ao forno pós-exposição durante 6 minutos a 95 °C.</li>
	<li>Desenvolva o wafer em revelador SU-8 por 15 s, enxágue-o com IPA e seque o wafer com N2, movendo-o de cima para baixo. NOTA: Ao desenvolver o wafer, verifique se ele está completamente submerso.</li>
	<li>Wafers estampados com spincoat com uma camada protetora de fotorresistência fina (SPR 955 CM 0,7) a 3000 rpm por 45 s e softbake por 30 s a 90 °C.</li>
	<li>Depositar uma fina camada de óxido de silício no wafer (2-3 nm) colocando-o numa deposição de camada atómica durante 22 ciclos a 100 °C.</li>
	<li>Use uma serra de cubos para cortar a bolacha em quadrados de 3 mm x 3 mm. Alinhe a serra de cubos ao padrão preexistente no wafer.</li>
	<li>Avaliar a geometria das fibras resultantes usando MEV a uma inclinação de 30° com um potencial de aceleração de 3 kV.</li>
	<li>Pare aqui se armazenar chips para uso a longo prazo (>1 semana). Guarde as fichas no escuro.</li>
	<li>Para separar substratos flexíveis de substratos rígidos, coloque cavacos individuais em acetona por 30 min ou até que o SU-8 comece a enrolar.</li>
	<li>Lavar os filmes de SU-8 (ligados ou destacados de substratos rígidos) com IPA por 5 min e depois com água por 5 min. Coloque os chips em uma caixa comercial com uma almofada adesiva ao transportá-los.</li>
	<li>OPCIONAL: Coloque o lado sem fibras do filme SU-8 em fita solúvel em água ou sobre borracha fina de silicone com um suporte fino de polietileno tereftalato (PET) (12,5 μm de espessura).<ol><li>Use uma pinça para transferir o filme SU-8. Pressione as bordas do quadrado SU-8 para ajudá-lo a grudar na fita/borracha de silicone-PET; Isso é para evitar o rompimento das fibras. Neste ponto, os filmes VACNF estão prontos para uso imediato.</li>
		<li>Para preparar um suporte de borracha de silicone/PET, faça o seguinte: usando um kit de 2 partes para borracha de silicone, misture as duas partes (o elastômero e o reticulante). Em seguida, recorte um quadrado de PET e tape-o em um prato de plástico transparente. Despeje uma camada muito fina de borracha de silicone sobre o PET e cure a 80 °C por 1-2 h.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Método na planta (onde uma gota de solução para entregar é colocada em uma superfície de planta) usando fibras em um substrato rígido (Figura 1A)
<ol><li>Remova o fotorresiste com lavagens incrementais de acetona (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) antes do uso.</li>
	<li>Coloque o tecido vegetal a ser empalado em uma superfície dura para suporte.</li>
	<li>Coloque uma gota de 1 μL de corante ou DNA (200 ng) na superfície do tecido vegetal.</li>
	<li>Coloque um chip VACNF com um substrato rígido na parte superior da gota, com as fibras orientadas de tal forma que entrem em contato com a gota. NOTA: A orientação dos chips pode ser determinada pelo "brilho" do wafer. O lado brilhante do chip tem fibras, e o lado opaco não.</li>
	<li>Usando o lado plano de uma pinça, toque no chip. Marque a área da planta com a qual o chip entrou em contato usando um marcador de ponta macia. Remova os chips VACNF após a entrega. NOTA: A quantidade de força aplicada ao bater irá variar dependendo do tipo de tecido vegetal utilizado. Recomenda-se praticar a batida de cavacos antes de realizar o empalamento das fibras. Evite danos aos tecidos vegetais. O dano é aparente quando se pode ver o contorno do chip VACNF no tecido vegetal.</li>
	<li>Repita as etapas 3.1-3.5 para controles (+Corante/DNA, -Fibras; -Corante/DNA, +Fibras; e -Corante/DNA, -Fibras). -Fibras é o lado sem fibras de um chip.</li>
	<li>Armazenar plantas intactas ou órgãos vegetais excisados em câmaras úmidas em condições de dias longos (16 h claro, 8 h escuro), se necessário. Para órgãos excisados, use uma placa de Petri de plástico com toalhas de papel molhadas.</li>
</ol>4. Método on-chip (onde uma gota de solução para entregar é colocada em um chip VACNF), substrato rígido (Figura 1B)
<ol><li>Remova o fotorresiste com lavagens incrementais de acetona (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) antes do uso.</li>
	<li>Gota de gota de 1 μL de corante ou DNA plasmidial (200 ng) no lado da fibra do chip VACNF com substrato rígido. Certifique-se de colocar a gota no centro do cavaco e cubra várias fibras. Deixe a gota secar por 15 min. NOTA: A orientação dos chips pode ser determinada pelo "brilho" do wafer. O lado brilhante do chip tem fibras, e o lado opaco não.</li>
	<li>Ao trabalhar com folhas ou outros órgãos excisados, coloque-os em cima de uma superfície dura. Ao trabalhar com plantas intactas, coloque uma superfície dura sob o órgão ao qual os VACNFs são aplicados.</li>
	<li>Após a etapa de secagem de 15 min, posicione o chip VACNF de forma que o lado da fibra entre em contato com o tecido vegetal. Toque no chip com a extremidade traseira de uma pinça. NOTA: A quantidade de força aplicada ao bater irá variar dependendo do tipo de tecido vegetal utilizado. Recomenda-se a prática de bater chips.</li>
	<li>Repita as etapas 3.6-3.7 do método na planta.</li>
</ol>5. Aplicação de VACNFs em filmes de SU-8 em tecidos vegetais usando o método on-chip (Figura 1C)
<ol><li>Coloque 1 μL de gota de corante ou DNA (200 ng) no lado da fibra do filme SU-8 e deixe secar por 10 min. Certifique-se de colocar a gota no centro do chip. OBS: Existem diferentes tempos de secagem dependendo do substrato utilizado.</li>
	<li>Usando um par de pinças afiadas, coloque o filme VACNF na superfície da planta. NOTA: Quanto mais tempo os filmes SU-8 são deixados no ar, mais frágeis os filmes se tornam. Para limitar o risco de perda dos filmes SU-8, certifique-se de ter todas as plantas/amostras e equipamentos perto dos filmes SU-8.</li>
	<li>Enrole suavemente um pequeno aplicador de maquiagem sobre a película VACNF. Marque as áreas onde os substratos flexíveis são colocados com um marcador de ponta macia. Remova os substratos flexíveis da superfície da planta usando fita adesiva. OBS: A quantidade de força aplicada ao enrolar o aplicador de maquiagem irá variar entre os tecidos vegetais utilizados. Pratique a aplicação dos filmes VACNF antes da realização da entrega de biomoléculas ou corantes. Danos visíveis aos tecidos vegetais são aparentes quando se pode ver os contornos do filme VACNF no tecido vegetal.</li>
	<li>Repita as etapas 5.1-5.3 para controles e plantas de armazenamento, conforme mencionado na etapa 3.7 do método na planta.</li>
</ol>6. Microscopia e análise de imagens para todos os métodos de entrega
<ol><li>Imageie as amostras usando um microscópio confocal usando comprimentos de onda de emissão e excitação adequados para a sonda/repórter fluorescente entregue. NOTA: O tempo necessário para a transformação transitória varia de acordo com a espécie vegetal e o marcador entregue. Por exemplo, a expressão de marcadores fluorescentes foi detectada após 48 h em Arabidopsis versus 96 h em folhas de alface7.</li>
	<li>Ao fazer imagens, tente focar em uma região com fibras descoladas. As fibras terão diferentes orientações. O sucesso da entrega não depende do aparecimento de fibras quebradas. NOTA: As fibras serão fluorescentes com os ajustes de excitação/emissão mais comuns devido à formação da camada de nitreto de silício resultante da formação de fibras no PECVD18.</li>
	<li>Capture pelo menos 5 imagens para cada amostra. O sinal resultante irá variar.</li>
	<li>Meça os valores de fluorescência como fluorescência total (densidade integrada) em áreas de imagem confocalde 20 μm x 20 μm 7 usando o ImageJ19.</li>
</ol>

Usando matrizes de nanofibras de carbono para entrega eficiente de biomoléculas e corantes às plantas

<ol>
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K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer.">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li><li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis.">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, apresentamos métodos para construir arranjos de nanofibras de carbono verticalmente alinhados, transferir as fibras para um substrato flexível e aplicar fibras em substrato rígido ou flexível em plantas para uso na entrega de biomoléculas ou corantes às plantas. Nós descrevemos duas abordagens gerais, o método on-chip e o método on-plant, para deposição dos materiais introduzidos e mostramos resultados bem sucedidos em fibras sobre substrato rígido, bem como o método on-chip usando filmes VACNF. A aplicação dessas fibras é mais simples na prática e na teoria do que os métodos tradicionais de transformação vegetal (bombardeio de partículas, transformação de protoplastos via PEG ou eletroporação) e podem ser usadas para plantas recalcitrantes à transformação mediada por Agrobacterium. No entanto, apenas algumas células são transformadas.
Nanofibras de carbono alinhadas verticalmente foram produzidas no Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences por meio de seu programa de usuário. Os usuários podem solicitar o uso dessa facilidade para a produção de VACNFs. Alternativamente, os cavacos VACNF podem ser produzidos em salas limpas com máquinas de deposição de vapor químico reforçadas por plasma de corrente contínua com uma fonte de carbono22,23. Com os métodos descritos, existem algumas etapas que são críticas para a produção das fibras, transferência de fibras e aplicação dos chips/filmes VACNF. Para que a aplicação das fibras funcione, as fibras devem ser retas e ter um diâmetro de afilamento de <200 nm na ponta para que a entrega em células vegetais seja bem-sucedida 6,7 (Figura 3). Para criar nanofibras de carbono de tamanho e passo específicos, há uma variedade de parâmetros que podem ser alterados, incluindo o tamanho do ponto, o passo lateral e a quantidade de catalisador depositado. Para selecionar o tamanho ideal de ponto a ser usado para a produção de nanofibras de carbono, as fibras foram cultivadas a partir de vários tamanhos de pontos (como mostrado na Figura 5). Verificamos que os diâmetros de 300 nm produziram as melhores fibras, por isso este tamanho de ponto foi selecionado (Figura 5). Depois de encontrar os parâmetros corretos, procuramos usar cavacos que tivessem >50% de fibras com geometria ideal (reta e diâmetro de ponta <200 nm). Para verificar a geometria das fibras, utilizou-se microscopia eletrônica de varredura para obter imagens aleatórias de campos de visão em uma amostra de chips/filmes VACNF.
Além disso, as fibras devem ter um certo comprimento mínimo para atingir a entrega dentro das células vegetais. A importância da produção de fibras de diferentes comprimentos é que fibras mais longas poderiam ser usadas para penetrar camadas mais profundas do tecido. Fibras mais longas (>40 μm de comprimento) são essenciais para filmes flexíveis, pois a transferência de fibras funciona quebrando as fibras de sua base e requer camadas de SU-8 sobre as fibras. A espessura de trabalho da camada SU-8 usada para este protocolo é de 20-35 μm. A altura mínima necessária para realizar o parto dentro da epiderme de várias plantas (curvas ou planas) é de 10-15 μm 6,7. Como resultado, fibras com comprimentos >40 μm são necessárias para filmes de VACNF. Existem vários parâmetros diferentes a serem considerados na produção de nanofibras de carbono: material catalisador, geometria do catalisador, espessura do material catalisador, bem como condições dentro da câmara PECVD (relação gás, pressão, temperatura, corrente, altura do chuveiro e tempo de crescimento)8,9,24,25. Para produzir nanofibras de carbono com mais de 25 μm utilizadas por Morgan et al.7 e Davern et al.6, aumentamos a quantidade de catalisador de Ni, alteramos a relação acetileno:amônia e aumentamos a corrente e o tempo de crescimento. Além disso, demos mais atenção à geometria do material catalisador. Para produzir fibras retas altas, o catalisador depositado precisava ter uma forma de puck de hóquei em vez de uma forma que se assemelhasse a um vulcão (Figura 4). Estruturas vulcânicas surgem de restos de fotorresistência após a decolagem. Para evitar a formação de vulcões, uma dupla camada de PMMA foi usada para criar um undercut durante a litografia por feixe de elétrons26. O undercut auxilia na decolagem do catalisador metálico depositado (Figura 2). A camada espessa do catalisador é importante para o crescimento de VACNFs altos. A morfologia dos VACNFs foi examinada por Merkulova et al.24. O alinhamento vertical dos VACNFs é devido tanto ao crescimento da ponta do catalisador de Ni quanto aos alinhamentos do potencial DC perpendicular ao substrato (Figura 6). O chuveiro descreve a geometria do reator PECVD (Figura 6) e serve como fonte para o potencial do campo elétrico27.
Para definir a matriz de pontos catalisadores com litografia por feixe de elétrons, aplicamos um resist de feixe de elétrons (polimetilmetacrilato), em seguida, usamos o feixe eletrônico para fazer pequenos furos no resiste com uma forma específica e em locais específicos no wafer. Os orifícios do diâmetro desejado foram colocados em uma grade regular com o espaçamento definido (pitch) e um arquivo especificando o padrão desejado foi carregado na ferramenta de litografia por feixe de elétrons antes de carregar o substrato na máquina. Além da altura da fibra, outro parâmetro crítico para o sucesso da transferência da fibra é a quantidade de tempo gasto no banho de acetona. Os filmes VACNF precisam ser deixados no banho de acetona por tempo suficiente para que suas bordas comecem a se enrolar; Se forem deixados no banho de acetona por muito pouco tempo, são mais difíceis de retirar as lascas e podem quebrar. Quanto mais velhos forem os chips, mais tempo eles terão que permanecer no banho de acetona. Após o banho de acetona, os filmes/chips foram colocados em isopropanol e água para remover a acetona de acesso, bem como remover o fotorresistente protetor sobre as fibras.
Para realizar o revestimento de spin, wafers ou peças de wafer são colocados em um mandril a vácuo no revestidor de spin, e a posição central do wafer é verificada usando a função de teste do revestidor de spin. Uma pequena poça (~2,5 cm de diâmetro) de resistência é aplicada ao centro do wafer e girada (3000 rpm por 45 s) Imagens das fibras antes e depois do revestimento de spin estão incluídas na Figura 8 mostrando a preservação da geometria das fibras (altura, orientação e pitch). A presença de fibras faz com que a resistência se aflore na base das fibras e resulta em camadas mais espessas do que o esperado. O spin-coating após o crescimento de VACNF tem sido explorado por outros grupos11,18.
Outra etapa dentro do processo que é de vital importância é garantir que a quantidade certa de força seja aplicada aos chips/filmes VACNF. O mecanismo de liberação é dependente de fibras fazendo pequenas perfurações nas paredes celulares através da força de impulso da pinça batendo em substratos rígidos 6,7 ou rolando com o mini-aplicador de maquiagem em substratos flexíveis. As fibras podem ou não se romper e permanecer embutidas nas células vegetais6,7 sem impacto no resultado, mas a prática em conjunto com o exame de captação de corante e dano tecidual é necessária para obter a pressão correta. Além disso, é importante escolher pontos de tempo de imagem apropriados após a entrega do DNA com chips/filmes VACNF, pois o tempo para a expressão detectável varia entre as espécies vegetais e os tipos de vetores que estão sendo liberados7 (Figura 16).
Por mais amplamente aplicável que este método seja às plantas, ele tem algumas limitações. Por exemplo, adicionar uma fina camada de óxido de silício aos filmes VACNF nem sempre resulta em filmes completamente hidrofílicos devido à camada protetora de fotorresistência adicionada sobre o SU-8. Se esse problema se materializar, camadas mais espessas de óxido de silício podem ser aplicadas aos VACNFs. Para testar se os filmes são hidrofóbicos ou hidrofílicos, eles podem ser colocados em água. Se os filmes afundam, são hidrofílicos e, se flutuam, são hidrofóbicos. Além disso, pode haver variação entre os lotes de fibras produzidas. Existem vários parâmetros que podem ser alterados ao crescer as fibras na máquina dc-PECVD; o que é descrito neste protocolo é um conjunto de parâmetros para duas quantidades diferentes de catalisador de Ni. Além disso, a orientação cristalina do catalisador de Ni não pode ser controlada28 e algumas ramificações inevitavelmente resultarão nas fibras.
Embora tenhamos demonstrado a entrega de corante fluoresceína e DNA para células vegetais usando substratos rígidos e flexíveis para este artigo, o método deve ser amplamente aplicável para outras abordagens de biomoléculas e modificação genética, por exemplo, silenciamento de RNAi para sistemas vegetais como maçãs ou outras frutas, onde levaria anos para produzir linhagens transgênicas estáveis. Além disso, essas fibras também podem ser usadas para entregar materiais de edição genética ou para transformações estáveis em plantas.

A transformação vegetal (transitória e estável) ainda não se tornou amplamente alcançável em todos os tecidos e espécies vegetais. A transformação transitória de plantas é um processo pelo qual genes codificados em plasmídeos são temporariamente introduzidos nas plantas, mas não são incorporados de forma estável ao genoma. Métodos tradicionais que usam bombardeamento de partículas, agrobactérias, eletroporação ou tratamento de polietilenoglicol de protoplastos são lentos ou podem ser complicados. Além disso, não são aplicáveis a todas as espécies vegetais 1,2,3,4. O uso de nanomateriais para a entrega de DNA é um campo em expansão que ainda está em sua infância5. Nanomateriais, especificamente nanofibras de carbono, também têm sido usados com sucesso para entregar proteínas, dextrans e corantes às folhas das plantas sem causar resposta a feridas6. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para o uso de um tipo de nanomaterial, nanofibras de carbono, para a entrega de biomoléculas ou corantes às plantas. Aqui, focamos no DNA como a biomolécula de escolha, que permite a transformação transitória de células em vários órgãos vegetais.
Anteriormente, Morgan et al.7 demonstraram o uso de nanofibras de carbono afixadas em substrato rígido de silício para transformar transitoriamente folhas de alface, N. benthamiana e álamo, e folhas e raízes de Arabidopsis. Embora as transformações tenham sido bem-sucedidas em uma variedade de órgãos, as fibras foram mais difíceis de aplicar em tecidos vegetais com superfícies curvas, como raízes ou frutos. Nós raciocinamos que um suporte flexível para nanofibras poderia melhorar sua eficiência de entrega, conformando-se melhor à forma do órgão.
Aqui, detalhamos os métodos utilizados para fabricar e projetar nanofibras de carbono verticalmente alinhadas, transferir VACNFs para substratos flexíveis e aplicar VACNFs em substratos rígidos e flexíveis para plantas para fornecer biomoléculas e corantes. Nanofibras de carbono foram produzidas usando deposição química de vapor reforçada por plasma catalítico de corrente contínua (dc C-PECVD) com catalisador de Ni. A posição, diâmetro e altura dos pontos catalisadores de Ni foram controlados usando uma combinação de litografia por feixe de elétrons, evaporação de metais e processos de decolagem, conforme descrito por Melechko et al.8,9. Usando um resiste de feixe eletrônico de camada dupla, um catalisador de Ni mais espesso pode ser depositado sobre o substrato para dar fibras mais longas10. A transferência de fibras de um substrato rígido para um substrato flexível é baseada em uma modificação dos métodos descritos em Fletcher et al.11, com os métodos atuais prevendo o uso de uma camada amorfa de carbono ou uma camada de fotorresistência sacrificial. A decolagem do SU-8 com transferência de fibras é obtida utilizando-se a tensão de tração intrínseca resultante do subcozimento e subexposição do SU-812,13,14. O SU-8, um polímero complexo, é naturalmente hidrofóbico, o que dificulta seu uso para facilitar a entrega de DNA. Para neutralizar a natureza hidrofóbica do SU-8, aplicamos uma fina camada de óxido de silício via deposição de camada atômica15 depois que as fibras são embutidas no SU-8. A aplicação de fibras em substrato rígido para liberação de biomoléculas/corantes utiliza a força de impacto do macheamento da pinça descrita em Davern et al.6 e os métodos on-plant e on-chip descritos em Morgan et al.7. Filmes flexíveis de VACNF são aplicados em superfícies curvas de plantas por meio de primeiro semi-secagem de DNA ou gotículas de corante sobre o filme, como no método on-chip de Morgan et al.7e, em seguida, rolando os filmes em superfícies curvas de plantas usando um pequeno aplicador de maquiagem16,17. A Figura 1 apresenta várias abordagens para a aplicação de fibras em substratos rígidos e flexíveis às plantas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

A entrega de biomoléculas e corantes impermeáveis a plantas intactas é um grande desafio. Os nanomateriais são ferramentas promissoras para a entrega de DNA às plantas. Por mais empolgantes que essas novas ferramentas sejam, elas ainda não foram amplamente aplicadas. Os nanomateriais fabricados em substrato rígido (suporte) são particularmente difíceis de aplicar com sucesso em estruturas vegetais curvas. Este estudo descreve o processo de microfabricação de arranjos de nanofibras de carbono verticalmente alinhados e transferi-los de um substrato rígido para um substrato flexível. Detalhamos e demonstramos como essas fibras (em substratos rígidos ou flexíveis) podem ser usadas para transformação transitória ou entrega de corantes (por exemplo, fluoresceína) para plantas. Mostramos como os VACNFs podem ser transferidos de substrato rígido de silício para um substrato epóxi flexível SU-8 para formar matrizes flexíveis de VACNF. Para superar a natureza hidrofóbica do SU-8, as fibras do filme flexível foram revestidas com uma fina camada de óxido de silício (2-3 nm). Para usar essas fibras para entrega a órgãos curvos de plantas, depositamos uma gota de 1 μL de corante ou solução de DNA no lado da fibra dos filmes de VACNF, esperamos 10 min, colocamos os filmes no órgão da planta e empregamos um cotonete com um movimento de rolamento para conduzir as fibras para dentro das células vegetais. Com este método, conseguimos a liberação de corante e DNA em órgãos vegetais com superfícies curvas.

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

Autor em destaque: Desbloqueando a transformação das plantas inovando com matrizes de nanofibras de carbono 

Uso de arranjos de nanofibras de carbono verticalmente alinhados em substratos rígidos ou flexíveis para entrega de biomoléculas e corantes às plantas

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

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Aqui descrevemos métodos para microfabricação de nanofibras de carbono verticalmente alinhadas (VACNFs), transferência de VACNFs para substratos flexíveis e aplicação de VACNFs em substratos rígidos e flexíveis para plantas para entrega de biomoléculas e corantes.

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

Estamos tentando demonstrar um método geral para entrega de corante ou DNA em plantas usando arranjos de nanofibras de carbono. Muitas plantas são recalcitrantes aos métodos tradicionais de transformação. Nosso método pode resolver este problema usando arranjos de nanofibras de carbono em substratos rígidos flexíveis.Nossa técnica é rápida e fácil de usar. Pode ser aplicado a praticamente qualquer espécie vegetal ou órgão vegetal. Ele também pode ser usado para fornecer outros reagentes, como corantes e proteínas.

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

924 visualizações.  The University of Chicago. Estamos tentando demonstrar um método geral para entrega de corante ou DNA em plantas usando arranjos de nanofibras de carbono. Muitas plantas são recalcitrantes aos métodos tradicionais de transformação. Nosso método pode resolver este problema usando arranjos de nanofibras de carbono em substratos rígidos flexíveis.Nossa técnica é rápida e fácil de usar. Pode ser aplicado a praticamente qualquer espécie vegetal ou órgão vegetal. Ele também pode ser usado para fornecer...

Vídeo: Autor em destaque: Desbloqueando a transformação das plantas inovando com matrizes de nanofibras de carbono 

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

Bioengenharia

On-Chip Method to Deliver Dye or Biomolecules to Plants Using VACNFs in a Flexible Substrate

Begin by preparing vertically aligned carbon nano fibers, or VACNFs. To transfer the VACNFs to a flexible substrate, first place the individual chips in acetone to separate the flexible substrate from the rigid substrate. Then, wash SU-8 films with IPA for five minutes, followed by washing with water for five minutes.Place the chips in a commercial box with a sticky pad when transporting them. Prepare a silicone rubber PET holder by mixing the elaststomer and the crosslinker from a two-part kit. Cut out a square of PET and tape it down in a clear plastic dish.Then, pour a very thin film of silicone rubber on top of the PET and cure it at 80 degrees Celsius for one to two hours. Transfer the SU-8 film to the PET holder using a pair of tweezers, and place the fiberless side of the SU-8 film on the silicone rubber. Press on the edges of the SU-8 square to help it stick to the silicone rubber PET and avoid breaking off fibers.Then, place a one microliter droplet of dye onto the fiber side of the SU-8 film and let it dry for 10 minutes. After drying, place the VACNF film onto the plant surface using a pair of sharp tweezers. Then, gently roll a small makeup applicator over the VACNF film.Mark the areas where the flexible substrates are placed with a soft tipped marker. Then remove the flexible substrates from the plant surface using tape. Repeat VACNF application for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film.The on-chip method was used to deliver fluorescein dye to curved surfaces, such as strawberries, in which a strong fluorescein signal was observed immediately. Whereas in apples, a strong fluorescein signal was seen after two hours of delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in apples.Also, a successful transient transformation of onions was done by delivering the plasmid containing yellow fluorescent protein using VACNF films.

Método On-Chip para Fornecer Corante ou Biomoléculas para Plantas Usando VACNFs em um Substrato Flexível

On-Plant Method to Deliver Dye or Biomolecules Using VACNFs in a Rigid Substrate

To begin, remove the photo resist from the VACNFs by washing with 100%acetone for five minutes, followed by a five minute wash with 100%IPA, and then double distilled water for five minutes. Then, place the plant tissue to be impaled on a hard surface for support. Place a one microliter droplet of dye onto the surface of the plant tissue.Place a VACNF chip with a rigid substrate down the top of the droplet, with the fibers oriented such that they will come into contact with the droplet. Using the flat side of a pair of tweezers, tap the chip, mark the area of the plant that the chip came into contact with using a soft tipped marker. Remove the VACNF chips after delivery.Repeat these steps for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film. Store intact plants or excised plant organs in humid chambers in long day conditions. For excised organs, use a plastic Petri dish with wet paper towels.Using this method, fluorescein dye was delivered to Arabidopsis leaves. Images taken at different time points, showed that the fluorescein dye was observed immediately after delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in Arabidopsis leaves.