Agradecemos Moustafa Saleh e Jay Tourigny pela leitura crítica do manuscrito e Steven Hahn e Steven Henikoff para orientação e apoio durante o desenvolvimento do ChEC-seq e sua aplicação ao complexo do Mediador. O SG é suportado por concessões do NIH R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ é suportado pelos fundos de inicialização da Universidade de Indiana.

1. Geração de cepas de fermento <ol><li> Gerar uma cepa de fermento com o fator de interesse etiquetado com MNase. <ol><li> O PCR amplifica a cassete de marcação MNase do vetor desejado ( Tabela 1 ) usando a mistura de reação especificada ( Tabela 2 ) e condições de ciclagem ( Tabela 3 ). Misture 5 μL da reação de PCR e 1 μL de corante de carga de DNA 6X. Execute cada alíquota de PCR em um gel de agarose a 0,8% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de ~ 2,3 kb. </li><li> Transforme a cassete de marcação amplificada para a tensão de escolha usando a transformação padrão de acetato de lítio 22 e execute a seleção. </li><li> Verifique a integração correta da cassete de marcação com PCR de colônia. <ol><li> Prepare a mistura de reação especificada ( Tabela 4 ) para o número de colônias a serem selecionadas. Mantenha-se gelado até ser necessário. </li><li> Escolha uma porção de cada colônia para ser tesDeslizou-se no fundo de um tubo de PCR usando um palito de palito esterilizado ou uma pipeta. </li><li> Microondas as colônias colhidas com alta potência durante 1 min. </li><li> Adicione 50 μL de mistura de PCR ( Tabela 4 ) a cada colônia de microondas e pipetar para cima e para baixo para misturar. Execute PCR usando as condições de ciclagem especificadas ( Tabela 5 ). </li><li> Misture os 50 μL de reação de PCR e 10 μL de corante de carga de DNA 6X diretamente em cada tubo de PCR. Executar 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 1% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de 700 pb. NOTA: Se desejado, verifique a expressão apropriada da proteína de fusão MNase por Western Blot. É esperada uma mudança de ~ 20,6 kilodalton no peso molecular da proteína marcada. </li></ol></li></ol></li><li> Gerar uma linhagem de MNase livre por clonagem baseada em homologia do promotor do gene de interesse em pGZ136 (Tabela 1) e transformação e seleção como no passo 1.1.2. <ol><li> AlternatiPor exemplo, montar o promotor do gene de interesse e 3xFLAG-MNase-SV40 NLS em um vetor plasmídico, transformar e selecionar como no passo 1.1.2 e cultivar a deformação na condição seletiva apropriada para a manutenção do plasmídeo. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> À tarde / noite do dia anterior ao experimento ChEC, inocule 3 mL de levedura-peptona-dextrose (YPD) ou meio seletivo apropriado com uma única colônia da cepa que contém o fator marcado com MNase. Incubar esta cultura durante a noite (agitação de 180 RPM, 30 ° C). </li><li> Na manhã do dia do experimento ChEC, diluir a cultura durante a noite em 50 mL de meio para uma densidade óptica a 600 nm (OD 600 ) de 0,2 a 0,3. Incubar esta cultura (180 RPM agitando, 30 ° C) até atingir uma DO 600 de 0,5-0,7. À medida que a cultura se aproxima do OD 600 apropriado, coloque o bloco de calor ou o banho de água a 30 ° C e comece a descongelar os aditivos Buffer A ( TaBle 6). </li><li> Prepare 5 mL de aditivos Buffer A plus ( Tabela 6 ) por cultura. Mantenha o buffer A na RT durante o procedimento. </li><li> Prepare tubos de microcentrífuga contendo 90 μL de solução de parada ( Tabela 7 ) e 10 μL de SDS a 10% para cada ponto de tempo a ser coletado. Para cada novo fator analisado, faça amostras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min. </li><li> Decantar a cultura em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar a 1.500 xg e a temperatura ambiente (RT) durante 1 min. </li><li> Ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A e transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A por pipetagem para cima e para baixo. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s. Repita este passo uma vez. </li><li> Ressuspender completamente as células em 570 μL de tampão A. Adicionar 30 μL de 2% de digitonina(0,1% de concentração final) para facilitar a permeabilização das células e inverter para misturar. </li><li> Permeabilize células em bloco de calor ou banho-maria a 30 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células. Remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas como um controle negativo para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS (passo 2.4) e vortex brevemente para misturar. </li><li> Adicione 1,1 μL de CaCl2 1 M (concentração final 2 mM) a células permeabilizadas para ativar MNase e inverter várias vezes rapidamente ou vortex brevemente para misturar. Volte imediatamente a reação mista a 30 ° C e comece um temporizador. </li><li> Em cada ponto de tempo a ser coletado, pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme de células, então remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS e vortex brevemente para misturar. Para cada novo fator analisado, tome 0 s (não adicionou CaCl 2 ), 30 s1 minuto, 2,5 min, 5 min e 10 minutos. NOTA: Experimentos de ChEC com fatores que rapidamente escinham DNA a 30 ° C podem ser realizados a temperaturas mais baixas para diminuir a cinética de clivagem de MNase. </li><li> Uma vez que todos os pontos de tempo foram coletados, adicione 4 μL de 20 mg / mL de proteinase K a cada amostra, vortex brevemente para misturar e incuba a 55 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 200 μL de fenol: cloroformo: álcool isoamílico a cada amostra, vortex vigorosamente para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min. </li><li> Remova cada fase aquosa (~ 150 μL) para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Vortex vigorosamente para misturar e precipitar em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa. </li><li> O precipitado precipitou DNA à velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min. </li><li> Decantar sobrenadantes e granulados de lavagem com 1 mL de RT 70% de etanol. </li><li> Decantar o etanol, remover o restante invando umD suavemente tocando os tubos em uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min. </li><li> Enquanto os grânulos estão secando, faça uma mistura principal para ressuspender os grânulos secos em 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μL de RNase A 10 mg / mL cada. Digerir ARN a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Misture 1 μL de corante de carga de DNA 6X com 5 μL de cada amostra e execute um gel de agarose a 1,5% a 120 V durante 40 min. </li></ol> 3. Seleção de tamanho NOTA: O objetivo da seleção de tamanho é remover fragmentos multi-kilobase de DNA genômico da amostra para ser sequenciado e enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente o tamanho do DNA nucleossômico) ou menor. Na sequenciação de dados, fragmentos &lt;400 pb são enriquecidos, com um pico notável em torno do tamanho do DNA nucleossômico (~ 150 pb) e uma distribuição máxima ou ampla de fragmentos subnucleosômicos. &lt;Ol&gt; <li> Para cada amostra, adicione 75 μL de contas de imobilização reversível em fase sólida (SPRI) em uma solução de polietileno glicol (PEG) 23 e pipetar para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar a contagem: mistura de DNA à TA por 5 min. </li><li> Durante a incubação do talão de SPRI, prepare tubos de microcentro contendo 96 μL de Tris 10 mM, pH 8,0 e 4 μL de NaCl 5 M para cada amostra. </li><li> Coloque os tubos num suporte magnético para coletar os grânulos no lado do tubo. Permitir que as pérolas coletem no lado do tubo por 2 min. </li><li> Transfira cada sobrenadante para um novo tubo contendo Tris e NaCl (passo 3.2). </li><li> Adicionar 200 μL de fenol: clorofórmio 25: 24: 1: álcool isoamílico a cada amostra, vórtice para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min. </li><li> Remova cada fase aquosa para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Precipitar o DNA em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa. </li><li> Pellet preciADN catiônico na velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min. </li><li> Decantar os sobrenadantes e lavar os grânulos com 1 mL de etanol a 70%. </li><li> Decantar o etanol, removendo o restante invando e batendo suavemente os tubos sobre uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min. </li><li> Ressuspender os grânulos secos em 25 μL de Tris, pH 8,0. Determine a concentração da amostra usando um teste de alta sensibilidade. Para experiências TF ChEC, o DNA 10-100 ng é rotineiramente recuperado após a seleção do tamanho. </li><li> Prepare bibliotecas de seqüenciamento. Os protocolos de preparação de bibliotecas que não dependem da seleção de tamanho, como descrito anteriormente 24 , são desejáveis ​​para permitir o seqüenciamento de uma grande variedade de tamanhos de fragmentos (25-500 pb). </li><li> Bibliotecas de seqüência no modo pareado. Um mínimo de 25 bases de sequência em cada extremidade é necessário para leitura de alta qualidademapeamento. Entre 1 e 2 milhões de leituras fornece cobertura suficiente para uma amostra ChEC. NOTA: A análise dos dados do ChEC-seq é um procedimento complexo e além do alcance deste artigo. Informações detalhadas sobre análise de dados podem ser encontradas nas publicações anteriores 1 , 21 e os scripts personalizados usados ​​para análise estão disponíveis no GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) também pode ser usado para análise de linha de comando de dados ChEC-seq. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Mostramos que o ChEC pode mapear diversas classes de proteínas de levedura na cromatina e antecipar que será amplamente aplicável a diferentes famílias de TFs e outros fatores de ligação à cromatina na levedura. O ChEC-seq é vantajoso porque não requer reticulação, solubilização da cromatina ou anticorpos. Assim, o ChEC evita artefactos potencialmente presentes no X-ChIP-seq, como o artefato 3 , 4 e o Chip nativo hiper-ChIPable, como os falsos negat...

O mapeamento dos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs), remodeladores de cromatina e outros fatores reguladores associados à cromatina é fundamental para entender todos os processos baseados em cromatina. Embora as abordagens de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (ChIP-seq) tenham sido usadas para obter muitos pontos de vista importantes sobre a biologia do genoma, eles apresentam limitações notáveis. Introduzimos recentemente um método alternativo, denominado clivagem endógena de cromatina e seqüenciamento de alto rendimento (ChEC-seq) 1 , para contornar essas desvantagens. O ChIP-seq é mais frequentemente realizado com um passo inicial de reticulação de formaldeído (X-ChIP-seq) para preservar as interações proteína-DNA. No entanto, uma série de estudos recentes indicaram que X-ChIP-seq captura interações transiente ou inespecífica proteína-DNA 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , dando origem a falsos locais de ligação positiva. Além disso, a sonicação, comumente usada para fragmentar a cromatina em experimentos X-ChIP-seq, preferencialmente cisa regiões de cromatina aberta, levando a recuperação tendenciosa de fragmentos dessas regiões 9 , 10 . A sonicação também produz uma mistura heterogênea de comprimentos de fragmentos, limitando, em última instância, a resolução do local de ligação, embora a adição de um passo de digestão com exonuclease possa melhorar muito a resolução 11 , 12 . Os métodos ChIP nativos, tais como regiões ocupadas de genomas, de cromatina naturalmente isolada purificada por afinidade (ORGÂNICO) 13 não utilizam reticulação e fragmentação de cromatina com nuclease microcócica (MNase), aliviando vieses de potencial associadas à reticulação de formaldeído e sonicação. Contudo,A solubilidade de muitas proteínas ligadas à cromatina sob as condições relativamente suaves requeridas para a extração nativa da cromatina é fraca, potencialmente levando a uma redução do alcance dinâmico e / ou falsos negativos 14 . Enquanto várias iterações de ChIP-seq são mais comumente usadas para mapeamento genômico de interações proteína-DNA, várias técnicas de mapeamento baseadas na fusão de proteínas de interesse para várias enzimas modificadoras de DNA também foram implementadas. Uma dessas abordagens é a identificação de DNA adenina metiltransferase (DamID) 15 , em que uma proteína de ligação à cromatina de interesse é geneticamente fundida em Dam e esta fusão é expressa em células ou animais, resultando em metilação de sequências de GATC proximais a locais de ligação para a proteína. DamID é vantajoso porque não depende da imunoprecipitação e evita a reticulação, os anticorpos ou a solubilização da cromatina. Também é realizado in vivo . Contudo, A resolução de DamID é limitada à escala de kilobase e a atividade de metilação da proteína de fusão de Dam é constitutiva. Um segundo método baseado na fusão enzimática é Calling Card-seq 16 , que emprega a fusão de um fator de interesse para uma transposase, direcionando a integração específica do site para os transposões. Como DamID, o Calling Card-seq não é baseado na imunoprecipitação e, portanto, tem vantagens semelhantes, com o benefício adicional de uma maior resolução. No entanto, Calling Card-seq pode ser limitado por viés de sequência das transposases e também depende da presença de locais de restrição próximos aos locais de inserção do transposão. Um terceiro método de fusão enzimática, desenvolvido no laboratório de Laemmli, é clivagem endógena da cromatina (ChEC) 17 . No ChEC, uma fusão entre uma proteína associada à cromatina e MNase é expressa nas células, e após a adição de cálcio para ativar a MNase, o DNA é cortado proximal aos locais de ligação para os marcadosFator ( Figura 1 ). Em conjunto com Southern Blot, o ChEC tem sido usado para caracterizar a estrutura da cromatina e a ligação de proteínas em vários loci individuais em leveduras 17 , 18 e foi combinado com análise de microarrays de baixa resolução para investigar a interação de componentes de poros nucleares com o fermento Genoma 19 . O ChEC oferece benefícios semelhantes a DamID e Calling Card-seq, e sua resolução é quase um par de bases únicas quando analisado pela extensão primária 19 . O ChEC também é controlável: a clivagem de DNA robusta por MNase depende da adição de cálcio milimolar, garantindo que o MNase seja inativo nas baixas concentrações de cálcio livres observadas em células de fermento vivas 20 . Anteriormente, postulamos que a combinação de ChEC com sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq) proporcionaria mapas de alta resolução de sites de ligação TF. Na verdade, ChEC-seq gerou mapas de alta resolução dos fatores reguladores gerais de fermento em broto (GRFs) Abf1, Rap1 e Reb1 em todo o genoma 1 . Também aplicamos o ChEC-seq com sucesso ao complexo Mediador modular, um coativador transcriptional global conservado e conservado 21 , expandindo a aplicabilidade dos complexos ChEC-seq para megadalton-size que não contatam diretamente o DNA e podem ser difíceis de serem mapeados pelo ChIP- Métodos baseados. O ChEC-seq é um método poderoso tanto para validação independente de resultados de ChIP-seq quanto para geração de novas idéias sobre a regulação de processos de residência de cromatina. Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a implementação deste método em fermento em brotamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

O mapeamento genômico de interações proteína-DNA é crítico para a compreensão da regulação de genes, remodelação de cromatina e outros processos residente em cromatina. A reticulação de formaldeído seguida de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (X-ChIP-seq) tem sido usada para obter muitas informações valiosas sobre a biologia do genoma. No entanto, X-ChIP-seq tem limitações notáveis ​​ligadas à reticulação e sonicação. O ChIP nativo evita essas desvantagens ao omitir reticulação, mas muitas vezes resulta em uma recuperação fraca de proteínas ligadas à cromatina. Além disso, todos os métodos baseados em ChIP estão sujeitos a considerações de qualidade de anticorpos. Métodos enzimáticos para mapear interações proteína-DNA, que envolvem a fusão de uma proteína de interesse para uma enzima modificadora de DNA, também foram utilizados para mapear interações proteína-DNA. Recentemente, combinamos um desses métodos, clivagem endógena de cromatina (ChEC), com sequenciação de alto rendimento como ChEC-seq. ChEC-seq depende da fusão de uma cromatina-assocProteína de interesse para a nuclease microcócica (MNase) para gerar clivagem de DNA direcionada na presença de cálcio nas células vivas. O ChEC-seq não se baseia na imunoprecipitação e evita possíveis preocupações com reticulação, sonicação, solubilização da cromatina e qualidade de anticorpos, ao mesmo tempo que fornece mapeamento de alta resolução com sinal mínimo de fundo. Nós imaginamos que o ChEC-seq será uma contrapartida poderosa para o ChIP, proporcionando um meio independente para validar as descobertas do ChIP-seq e descobrir novas idéias sobre a regulação genômica.

No caso de um experimento de ChEC bem sucedido, a análise do DNA por eletroforese em gel de agarose revelará um aumento dependente do cálcio na fragmentação do DNA ao longo do tempo, conforme indicado por manchas e eventual digestão completa do DNA genômico. Em alguns casos, observa-se uma escala de bandas semelhante à observada com uma digestão MNase tradicional após a digestão prolongada. Este é o caso da análise ChEC do Reb1, um fator regulatório geral que liga as regiõ...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K visualizações.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase). 

Vídeo: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...