Obrigado a Willy Sun para assistência técnica e Dr. Kris Gellynck para comentários úteis e três revisores anônimos por seus conselhos construtivos. Este trabalho foi financiado pela Iniciativa Regeneração Audiência Sunnybrook

Tecido Mouse foi colhida a partir de Sox2 EGFP -reporter camundongos mantidos 12 e sacrificados de acordo com o Canadian Council on Animal Care diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório. 1. A cultura embrionária cóclea <ol><li> Suplemento de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) por mistura de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de soro fetal bovino (FBS), 100 ul de 100x suplemento N2, e 10 ul de 10 mg / ml ciprofloxacina. Suplemento Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) por mistura de 495 ml de HBSS com 5 ml de 100% de HEPES. </li><li> Prepare vidro placas de cultura de fundo: <ol><li> Em uma câmara de fluxo laminar, ressuspender 200 ul porão substrato extracto de membrana em 5 ml de DMEM. Prepare 35 milímetros de vidro diâmetro placas de cultura de fundo com 10 poços mm. Pipetar 150 ul de substrato / DMEM para o centro de cada prato de vidro de fundo. Estes pratos podem ser utilizados depois de 40 min de incubação, ou pode armazenada num CO 2 </sub&gt; Incubadora a 35 ° C durante pelo menos uma semana. NOTA: O vidro de fundo pratos são utilizados para as seguintes razões: para assegurar que a base do prato é transparente e adequado para imagiologia, para criar um buraco no centro do prato que permite que os explantes para se estabelecer em uma área facilmente localizado e finalmente de modo que, depois de uma experiência, a amostra pode ser processado para imunocoloração e análise subsequente. </li></ol></li><li> Prepare o posto de trabalho e ferramentas: <ol><li> Ligue o fluxo laminar banco limpo e lavar com etanol 70% para criar um espaço de trabalho limpo. Mergulhe pinças, colheres, e um preto 184 elastômero de silicone prato (uma mistura de 184 elastômero de silicone (10 partes), agente (1 parte) e carvão vegetal em pó (2,5 g) de cura) em etanol 70%. </li></ol></li><li> Na estação de trabalho limpa, embriões colheita para o experimento. Coletar embriões de gestação apropriado no gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES. <ol><li> Determinar um órgão externo ou visível que vai demonstraratividade repórter e examinar os embriões usando um microscópio estéreo fluorescente. Recolher os embriões que apresentam actividade repórter em gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES como estes são o objecto da experiência. </li></ol></li><li> Recolha ossos temporais: <ol><li> Trabalhando rapidamente, usando uma fonte de luz fria e uma pinça fina, recolher as cabeças dos filhotes. Tome cuidado para cortar na vértebra cervical e abaixo do queixo, para evitar danos aos ossos temporais. </li><li> Abra cuidadosamente o crânio. Remover o cérebro, aparar a parte frontal da cabeça, e transferir o posterior do crânio para gelo HBSS frio fresco suplementado com 1% de HEPES em um prato limpo. Dissecar cuidadosamente os ossos temporais em forma de amendoim tendo o cuidado de manter o sistema vestibular no tato. </li></ol></li><li> Dissecar a cóclea: <ol><li> Transfira os ossos temporais para um prato revestido de elastômero de silicone preto no gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES, fixar a região vestibular do osso. Insira os pinos de insetos emum ângulo oblíquo, a fim de estabilizar o osso temporal e criar espaço para a pinça. Cravado é um passo crucial no processo como se o osso temporal pode se mover muito, é muito difícil para colher uma cóclea intacta. </li><li> Cuidadosamente retire a cartilagem ao redor da cóclea. Inserir um dente do fórceps para a cartilagem na borda exterior da base da cóclea e cortar um furo para a cartilagem. </li><li> Clipe uma aba para cima o lado, inserir o dente do fórceps e suavemente separar o telhado da conduta a partir da cartilagem. Clipe horizontalmente na parte superior e na diagonal, e com cuidado levante a parte da frente da cápsula. Insira um pino da pinça entre a cartilagem restante eo duto e gentilmente cortar fora a última seção. A superfície apical da cóclea está agora exposta. </li><li> Começando na base, apanhar a área onde o telhado da conduta se encontra com o epitélio coclear e abrir o ducto coclear. Retire suavemente o telhado, aparandoquando necessário, até que esteja completamente removida. Apare fora qualquer porção de membrana esquerda no lado medial do duto. Limpe a conduta de excesso de tecido mesenquimal e retire o duto do sistema vestibular. </li></ol></li><li> Cultura explantes: <ol><li> Coloque um explante, luminal superfície para cima, no centro de um substrato de vidro revestido cultura inferior prato, cuidadosamente desenhar fora todo o líquido e deixe por dois minutos. Adicionar 150 mL de DMEM suplementados gota a gota para o explante, tomando cuidado para não perturbá-la. Caso o explante flutuar livremente, reposicionar com uma pinça, mas tomar cuidado para que o explante deposita-se no fundo do prato de modo que ele pode anexar ao substrato. </li><li> Coloque os pratos com fundo de vidro em uma profunda 12 centímetros de diâmetro prato de petri, com um pequeno prato de água estéril para manter a umidade. Coloque as culturas para uma incubadora a 35 ° C durante a noite para que o explante para anexar ao substrato e achatar. </li></ol></li></ol> 2. Vivo Imaging <ol><li> Selecione amostras de explante. Use um microscópio estéreo fluorescente para avaliar a condição de cada cóclea explante. Somente selecione explantes, onde o duto está intacta e anexado ao vidro da base ao ápice. </li><li> Definir a incubadora a 35 ° C com 5% de CO 2 para cultura de tecidos coclear. Coloque as culturas no incubador microscópio: <ol><li> Gentilmente aspirar fora do DMEM suplementado e substituir com pelo menos 500 mL de mídia fresco. Para geração de imagens até 6 dias, 1-1,5 ml é melhor. Nos casos em que os explantes estão frouxamente ligados, pipetar um anel de meios de comunicação em torno da borda do prato. Este líquido extra vai fazer uma &quot;câmara úmida&quot; em miniatura, sem perturbar o explante, enquanto que continua a atribuir à matriz. <ol><li> Alternativamente, o uso articulado prato cobre para abrir as pálpebras, enquanto o prato permanece em sua instalação no microscópio se os reagentes precisam ser trocadas durante os intervalos entre coleções de imagens. Tampas articuladas prato permitir que as tampas para serabriu sem perturbar as amostras ou remover os pratos de suas configurações. Isso mantém a sua posição exata para captura de imagens subsequentes. </li></ol></li><li> Inserir os pratos de vidro de fundo contendo amostras adequadas no suporte do prato de amostras. O microscópio, neste exemplo, tem uma plataforma rotativa que contém oito pratos de 35 milímetros de amostra. </li><li> Sob o capô fluxo laminar substituir as tampas de plástico com tampas de vidro e coloque os pratos no suporte do prato de amostras. Coloque o suporte do prato de amostras dentro da incubadora tomando cuidado para não desalojar os explantes a partir do fundo do prato ou perturbar os meios de comunicação. </li></ol></li><li> Configure a rotina de imagem: <ol><li> Ligue o microscópio, lâmpada UV e câmera e abra o software de imagem. </li><li> Localize as amostras, escolher uma área de imagem, plano de foco e ajustar os tempos de exposição para cada prato em sequência. Escolha do plano de foco em função não só a visão do explante no momento da partida, mas aiassim tendo em conta a forma como o tecido vai passar e quanto tempo o curso do tempo será executado. </li><li> Definir uma pilha Z centralização em torno do plano focal selecionado no canal de fluorescência. Defina a frequência ea duração da amostragem para o experimento. A frequência de amostragem será limitado pelo tempo que leva para coletar imagens, de modo que este deve ser determinado após a seleção de campos de visão e definir uma pilha Z. Neste caso, a amostragem ocorre a cada 30 minutos durante cinco dias. A duração da experiência pode ser de até 14 dias. </li></ol></li><li> Gerar um filme: <ol><li> No final do período de intervalo de tempo abrir os ficheiros de imagem. Neste caso, o software Metamorph que abre pontos de recolha sequenciais é utilizada. Quadro a quadro escolher o melhor plano focal para mostrar a população de células de interesse. </li><li> Converter essas imagens para um arquivo .avi, ou exportá-los como uma montagem para gerar um conjunto de imagens que podem ser abertos e analisados ​​no software de processamento de imagem ou convertidos em forma múltiplats usando o software de processamento de vídeo. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Há vários pontos técnicos a considerar quando as culturas são estabelecidas e na criação do microscópio de lapso de tempo, a fim de imagem a longo prazo. Usamos matriz da membrana basal, como um substrato para a cultura de explantes de cóclea, mas o substrato deve ser compatível com o tipo de célula. Por exemplo, a imagem culturas neuronais, pode ser melhor para proporcionar um revestimento de fibronectina. A temperatura de incubação e composição do gás também deve ser escolh...

A cóclea dos mamíferos é um órgão complexo altamente ordenada. No rato, entre o surgimento do ouvido interno primitivo da vesícula ótica no dia E11 e conclusão do programa de desenvolvimento em fases pós-natais, várias ondas de sinalização celular e mudanças coordenadas na expressão gênica ocorrem. Correndo de base para o ápice do ducto coclear é o som detectar epitélio sensorial, ou órgão de Corti. Desenvolvimento do órgão de Corti é primorosamente controlada de tal forma que até o final de desenvolvimento, ele será composto de uma única fileira de células ciliadas internas, três fileiras de células ciliadas externas intercaladas com cinco fileiras de células de suporte (duas fileiras de células pilares, três linhas de células de Deiters &#39;) 1. Desvio dessa ordem resultados precisos em perda auditiva, heighlighting a importância de studye ofthe gênese e padronização do epithemlium sensorial 2. Cultivo in vitro da coch embrionárias de ratolea é uma ferramenta essencial para o estudo dos mecanismos de desenvolvimento do órgão de Corti. Esta técnica foi estabelecido em 1974 e ao longo dos últimos 40 anos, tem sido utilizado para elucidar muitos dos mecanismos pelos quais o epitélio sensorial é especificado e o órgão de Corti estabelecidos 3. A cóclea é um órgão complexo com processos de desenvolvimento dinâmicos; uma manipulação pode levar até sete dias para manifestar um. Por exemplo, quando a adição de inibidores de GSK 3β a uma cultura de explante da cóclea em E13, o período de incubação óptimo para observar um efeito robusto do que o composto é seis dias 4. Imagens ao vivo da cóclea desenvolvimento permite investigação sobre as mudanças na morfologia do órgão de Corti, mudanças na expressão gênica, acompanhamento de migração, proliferação ou células que morrem, e isso permite a observação em tempo real dos resultados dos agentes farmacêuticos e rompimento de sinalização percursos. Até agora, a imagem da cóclea viverfoi principalmente realizada usando microscopia confocal a imagem pequenas áreas do órgão de Corti ao longo de períodos de tempo curtos 5-8, mas esta técnica tem limitações devido a viabilidade explante. Em imagiologia dos efeitos das manipulações de longo prazo sobre os processos de desenvolvimento lento, o ambiente de imagem é crucial. Normalmente, um sistema de imagem ao vivo confocal utiliza uma caixa de plástico umidificado que se senta no microscópio. O calor e humidade pode escapar através das aberturas na caixa de incubação onde se encontra com a tabela de microscópio, através das janelas de acesso, através das aberturas articuladas e através das lacunas em torno de várias partes do microscope- tais como o objectivo ou a fonte de luz. Este não é o ideal para a manutenção de explantes saudáveis ​​por mais do que dois ou três dias. Nós definimos &#39;incubadora microscópio&#39; como um microscópio invertido vedado dentro de uma incubadora de CO 2 padrão, em vez de uma incubadora construído em torno do microscópio. Uma incubadora microscópio extende a vida do experimento de tal modo que, em vez de imagem ao longo de dois ou três dias, as amostras podem ser visualizados por até duas semanas. Um microscópio incubadora oferece um excelente ambiente para o crescimento e diferenciação celular, com o mínimo de perturbação explantar culturas e condições padrão controlado. Em estudos que têm lugar ao longo de vários dias, é comum recorrer a amostras de imagem numa base diária, removendo-os da incubadora e levando-as a um microscópio de fluorescência invertido. Embora essa abordagem possa funcionar, de retirar os pratos da incubadora inflige estresse sobre o tecido em desenvolvimento sensível. Mudanças na acidez do meio de cultura e as flutuações na temperatura devido à remoção da incubadora pode resultar em desenvolvimento abaixo do ideal e do tecido saudável. Imagiologia da mesma região no mesmo plano focal e com a mesma orientação em cada ponto de tempo é extremamente desafiador. Ao utilizar um sistema automatizado dentro de uma incubadora, é possível manter saudáveltecido, para recolher imagens em mais pontos de tempo e para assegurar que a mesma área seja capturado em cada quadro. Nos últimos anos têm sido desenvolvidas várias incubadoras microscópio de tecido integrados, estes têm sido úteis não só na prática clínica 9, mas também em células estaminais e cancro da investigação 10,11. Aqui apresentamos um protocolo para criação de imagens ao vivo de longo prazo de explantes embrionárias de rato cocleares. Usamos um sistema de microscopia automatizada dentro de uma incubadora de CO 2 padrão que tem a capacidade de capturar imagens de várias amostras em pontos de tempo definido. O sistema consiste de um microscópio invertido definido dentro de uma incubadora. As amostras são colocadas num estrado rotativo que permite imagens de múltiplas amostras em cada ponto de tempo. Iluminação, captura de imagem e rotação do estrado são controlados por um sistema automatizado operado através de software Metamorph. Ao definir uma rotina de imagem usando o software operacional, podemos definir um experimento para funcionar por até twO semanas com mínima intervenção humana. Neste exemplo, vamos usar tanto de campo claro e fluorescência para mostrar crescimento em larga escala e rearranjo da cóclea e, especificamente, a região prosensory. Neste experimento, cóclea serão dissecados de ratos repórter Sox2 EGFP no dia embrionário E13. Será estabelecida culturas in vitro e depois trabalhada ao longo de cinco dias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Aqui apresentamos um método para longo prazo de imagem time-lapse de explantes embrionárias de rato cocleares ao vivo. O programa de desenvolvimento responsável pela construção da altamente ordenada, estrutura complexa da cóclea de mamíferos prossegue por cerca de dez dias. A fim de estudar alterações na expressão do gene ao longo deste período e a sua resposta a farmacêutica ou manipulação genética, a imagem latente a longo prazo é necessário. Anteriormente, imagens ao vivo tem sido tipicamente limitada pela viabilidade do tecido explantado numa câmara humidificada em cima de um microscópio padrão. Dificuldade em manter condições óptimas para o crescimento da cultura no que respeita à humidade e temperatura colocou limites no comprimento de experimentos de imagem. Um microscópio integrados em um incubador de cultura de tecido modificado proporciona um ambiente excelente para a imagem latente a longo prazo ao vivo. Neste método demonstramos como estabelecer rato embrionárias explantes cocleares e como usar um microscópio de incubadora para realizar lapso de tempo imaging utilizando tanto microscopia de campo brilhante e fluorescência para examinar o comportamento de um dia de desenvolvimento embrionário normal (E) e 13 de explante da cóclea Sox2, um marcador das células prosensory da cóclea, ao longo de 5 dias.

Aqui nós mostramos uma montagem (Figura 1) e um filme (Figura 2), demonstrando como um explante coclear organotípico típico vai crescer se banhado em E13.5. Um repórter do mouse Sox2 foi usado para visualizar a região prosensory. O filme ilustra que a cóclea sofre de crescimento e convergência e extensão, as células na região lateral do domínio Sox2 verde não parecem tão dividir o tecido circundante que se expande. Esta é uma característica do órgão de...

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K visualizações.  Sunnybrook Research Institute.  Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias. 

Vídeo: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...