Yazarlar, bu makalede analiz edilen hayvan dokularını sağladıkları için Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble ve Matthias Selhausen'e teşekkür eder. Ayrıca biyoinformatik destekleri için Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki ve Martin Ebeling'e teşekkür ederiz.

Tüm hayvan çalışmaları, Basel-Stadt kanton veterinerlik otoritesinin onayıyla, hayvanların korunmasına ilişkin İsviçre federal düzenlemelerine sıkı sıkıya bağlı kalınarak veya Alman Hayvan Refahı Yasası'na uygun olarak Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Doku ve reaktif / alet hazırlama
<ol><li>Temizlik ve cihaz hazırlama<ol><li>Tezgahları ve cımbızları %70 etanol ve RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin. Santrifüjleri 4 °C'ye kadar önceden soğutun.</li>
		<li>Çekirdek izolasyon kartuşlarını buzdolabında 4 °C'de en az 30 dakika önceden soğutun.</li>
		<li>Robotik ayırıcıyı başlatın ve ekranın sağ üst köşesindeki kaydırıcıyı soğumaya ayarlayarak ve kaydırıcının turuncu görünmesi için soğutmayı başlatmak için üzerine tıklayarak soğutmayı açın. Takılı çekirdek depolama reaktifi (NSR) şişesinde ve çekirdek izolasyon tamponu (NIB) şişesinde yeterli sıvı kaldığını ve uygun şekilde soğutulduğunu kontrol edin.</li>
		<li>Kuru buzla dolu bir polistiren köpük kutu hazırlayın ve Petri kaplarını ve neşter bıçaklarını kuru buz üzerinde önceden soğutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Tampon hazırlama<ol><li>1.5 M sükroz yastık çözeltisini (SCS) Tablo 1'de gösterildiği gibi hazırlayın. Numune başına dört adet 500 μL SCS alikotu elde etmek için SCS'yi 2 mL DNase/RNase tüplerinde 500 μL'lik alikotlara dağıtın. Daha fazla kullanana kadar alikotları buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Beyin dokusunun işlenmesi durumunda, bunun yerine, NSR'de silika kolloid stok çözeltisini seyrelterek ve RNaz inhibitörü ekleyerek Tablo 2'de tarif edildiği gibi% 18'lik bir silika kolloid çözeltisi hazırlayın. Numune başına 3 mL% 18 silika kolloid çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Doku homojenizasyonu ve çekirdek izolasyonu
<ol><li>Numuneyi -80 °C dondurucudan çıkarın ve hemen kuru buzun üzerine koyun.</li>
	<li>Numuneyi önceden soğutulmuş bir Petri kabı veya kuru buz üzerinde metal bir plaka üzerinde önceden soğutulmuş bir neşter ile 15-50 mg'lık bir parçaya kesin (zaten doğru boyutta değilse). Numuneyi doğru yönde kestiğinizden emin olun, böylece numune hala ilgilenilen organ yapılarını temsil eder. NOT: Bu protokolle, nükleer ekstraksiyon için en uygun numune boyutu 15-50 mg'dır. Temizlemeden sonra iyi bir verim elde etmek için en az 25 mg'lık bir numune boyutu önerilir. Daha küçük numuneler için, robotik ayrıştırıcı ile küçük girdileri işlemek için optimize edilmiş özel kartuşlar mevcuttur. Aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için yeterli verimle 4 mg ağırlığındaki doku örneklerini ayırmak için küçük giriş çekirdeği izolasyon kartuşları kullanıldı. Sıçan karaciğer dokusundan düşük girdili kartuş kullanılarak çekirdek verimine bir örnek Tablo 3'te gösterilmektedir.</li>
	<li>Çekirdek izolasyon kartuşunu buzdolabından çıkarın, ambalajından çıkarın, öğütücüyü çıkarın ve kartuşun altına 15 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL) pipetleyin. NOT: Çekirdek ekstraksiyonu sırasında, robotik ayrıştırıcı, kartuşa toplam 3 mL hacme kadar (düşük hacimli çekirdek ekstraksiyon protokolü ile) NIB ve NSR ekleyecektir. Ekstraksiyondan önce kartuşa 15 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL) eklenerek, süspansiyon 0.2 U/μL'lik istenen RNAse inhibitör konsantrasyonuna sahip olacaktır.</li>
	<li>Doku örneğini cımbız kullanarak kartuşun altına yerleştirin. Optimum bozulma verimliliğine sahip olmak için numuneyi tam olarak kartuşun ortasına yerleştirmeyin.</li>
	<li>Cihazda Protokol Çalıştır'ı seçin ve sol üst köşedeki Nuclei seçeneğine tıklayın.<ol><li>Menüden Düşük Hacimli Çekirdek İzolasyon protokolünü seçin ve Değiştir'e tıklayarak bozulma hızının hızlı olarak ayarlandığını doğrulayın. Kapağı açarak ve s'yi dışarı kaydırarak kartuşu cihaza yükleyin.tage kırmızı düğmeyi kaldırarak.</li>
		<li>Kartuşu belirlenen konuma yerleştirin, kartuş kilidini çevirin ve s'de kaydırıntage kırmızı düğme yerine oturana kadar. Kapıyı kapatın ve İleri'ye tıklayarak cihazda çekirdek çıkarma işlemini başlatın. Koşu yaklaşık 7 dakika sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Çalıştırma bittiğinde, kırmızı düğmeyi kaldırarak ve s'yi dışarı çekerek kartuşu cihazdan çıkarın.tage. Kartuşu hemen buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Beyin dışındaki tüm dokular için adım 3.1'e geçin. Beyin örnekleri için doğrudan adım 3.2'ye geçin.</li>
</ol>3. Çekirdek temizleme
<ol><li>Sükroz gradyan temizliği NOT: Beyin dokusu için bu adımı atlayın ve doğrudan adım 3.2'ye gidin. RNA bozulmasını en aza indirmek için tüm temizleme adımları buz üzerinde gerçekleştirilir. Tamponlar ve tüplerin yanı sıra santrifüjlerin de önceden soğutulması gerekir. Girdaplama çekirdeklerin kalitesini ve bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden, tüm yeniden süspansiyon ve karıştırma adımları yalnızca dikkatli pipetleme ile gerçekleştirilir.<ol><li>Ayrıştırıcı kartuşundaki yuvarlak folyoyu bir pipet ucuyla dikkatlice delin. NOT: Ayrışmadan sonra, ortaya çıkan çekirdek süspansiyonu yaklaşık 2 mL'lik bir hacme sahiptir. Sükroz gradyan temizliğini kolaylaştırmak için, çekirdek süspansiyonunu iki adet 900 μL'lik alikotlara bölün, bu da temizleme sırasında toplam 1.8 mL çekirdek süspansiyonu hacminin kullanılmasına neden olur.</li>
		<li>Çekirdek süspansiyonunun ilk 900 μL'lik alikotunu kartuştan çıkarın ve daha önce 2 mL'lik bir tüpte hazırlanmış 500 μL'lik bir SCS alikotuna ekleyin. Karışım homojen olana kadar pipetleyerek iyice karıştırın.</li>
		<li>1400 μL çekirdek süspansiyonu - SCS karışımını çıkarın ve tüpü bir açıyla tutarak ve karışımı damla damla ekleyerek açıkça görülebilen bir faz ayrımı oluşturarak dikkatlice yeni bir 500 μL SCS alikotu üzerine katmanlayın (bkz. Şekil 1A).</li>
		<li>Tüpü dikkatlice kapatın ve faz ayrımını bozmadan tekrar buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Gradyan santrifüjleme için açıkça görülebilen bir faz ayrımı ile numune başına iki adet 2 mL tüpe sahip olmak için ikinci 900 μL'lik süspansiyon alikotu ve yeni bir SCS alikotu ile 3.1.2-3.1.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Tüpleri dikkatlice önceden soğutulmuş bir santrifüje ekleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürün.</li>
		<li>Bu arada, Tablo 4'te açıklanan NSR'yi, NSR'nin bir alikotuna RNaz inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Numune başına 1 mL NSR hazırlayın. NOT: Bu noktada, tek hücreli gen ekspresyonu reaktifi jel boncukları -80 °C dondurucudan çıkarılabilir, bu da oda sıcaklığına (RT) dengelenmelerine izin verir ve şablon anahtarı oligo, düşük TE tamponunda yeniden süspanse edilebilir.</li>
		<li>Santrifüjlemeden sonra, peleti bozmadan süpernatanı her iki tüpten çıkarın ve üreticinin tavsiyesine göre peleti 50 μL buz gibi soğuk NSR'de dikkatlice yeniden süspanse edin. Aynı numunenin iki peletini 1,5 mL'lik yeni bir tüpte toplayın ve toplam 1 mL hacme 900 μL buz gibi soğuk NSR ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın.</li>
		<li>Numuneyi 500 x g'da 5 °C'de 4 dakika boyunca sallanan kovalı rotor santrifüjü ile santrifüjleyin. NOT: Çekirdek kaybını en aza indirmek için, özellikle çekirdek veriminin düşük olması beklendiğinde veya az miktarda doku ile başlarken, sallanan bir kova rotoru kullanılması şiddetle tavsiye edilir.</li>
		<li>Bu arada, Tablo 5'te tarif edildiği gibi% 0.04 sığır serum albümini (BSA) ve 0.2 U / μL RNaz inhibitörü ile 1x PBS (Ca2+ ve Mg2 + olmadan) numunesi başına 500 μL hazırlayın.</li>
		<li>Peletleri atmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti yukarıda hazırlandığı gibi 100 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin (0.2 U / μL'de 1x PBS +% 0.04 BSA + RNaz inhibitörü). NOT: Küçük doku örnekleri için çekirdek konsantrasyonu düşük olabilir ve bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi için yeterince yüksek konsantrasyonlar sağlamak için peletin sadece 50 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edilmesi önerilir.</li>
		<li>Doğrudan 4. adıma geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Silika kolloid gradyan temizleme NOT: Beyin dokusu için, bir silika kolloid gradyanı, miyelin ve kalıntıları çekirdek süspansiyonundan çıkarmak için bir sükroz gradyanından daha uygundur. RNA bozulmasını en aza indirmek için tüm temizleme adımları buz üzerinde gerçekleştirilir. Tamponlar ve tüplerin yanı sıra santrifüjlerin de önceden soğutulması gerekir. Girdaplama çekirdeklerin kalitesini ve bütünlüğünü tehlikeye atabileceğinden, tüm yeniden süspansiyon ve karıştırma adımları yalnızca dikkatli pipetleme ile gerçekleştirilir.<ol><li>Ayrıştırıcı kartuşundaki yuvarlak folyoyu bir pipet ucuyla dikkatlice delin.</li>
		<li>Çekirdek süspansiyonunu kartuştan çıkarın ve 5 mL'lik bir tüpe ekleyin.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mL buz gibi soğuk %18 silika kolloid solüsyonunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Toplam hacmi 3 mL olacak şekilde 2 mL ilave %18 silika kolloid çözeltisi ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.</li>
		<li>Numuneyi 700 x g'da 5 °C'de 4 dakika boyunca fren ayarlıyken sallanan kovalı bir rotorda santrifüjleyin.</li>
		<li>Bu arada, Tablo 4'te açıklanan NSR'yi, NSR'nin bir alikotuna RNaz inhibitörü ekleyerek hazırlayın. Numune başına 1 mL NSR hazırlayın. NOT: Bu noktada, tek hücreli gen ekspresyon reaktifi jel boncukları -80 °C dondurucudan çıkarılabilir, bu da RT'ye dengelenmesini sağlar ve şablon anahtarı oligosu düşük TE tamponunda yeniden süspanse edilebilir.</li>
		<li>Üstte yüzen miyelin tabakasını bozmadan numuneyi santrifüjden dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>İlk olarak, miyelin tabakasını üstten çıkarın ve atın; Ardından, peleti bozmadan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. NOT: Miyelin tabakası, 1-2 mL süpernatan ile birlikte miyelin tabakasını aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet ucunun etrafına steril, tüy bırakmayan bir mendil sarılarak kolayca çıkarılabilir.</li>
		<li>Üreticinin tavsiyesine göre peleti 1 mL buz gibi soğuk NSR'de yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Numuneyi 500 x g'da 5 °C'de 4 dakika boyunca sallanan kova rotorlu bir santrifüjde santrifüjleyin. NOT: Çekirdek kaybını en aza indirmek için, özellikle çekirdek veriminin düşük olması beklendiğinde veya az miktarda doku ile başlarken, sallanan bir kova rotoru kullanılması şiddetle tavsiye edilir.</li>
		<li>Bu arada, Tablo 5'te tarif edildiği gibi% 0.04 sığır serum albümini (BSA) ve 0.2 U / μL RNaz inhibitörü ile 1x PBS (Ca2+ ve Mg2 + olmadan) numunesi başına 500 μL hazırlayın.</li>
		<li>Süpernatanı peleti bozmadan dikkatlice çıkarın ve numuneyi yukarıda hazırlandığı gibi 100 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin (0,2 U/μL'de 1x PBS + %0,04 BSA + RNaz inhibitörü). NOT: Küçük doku örnekleri için çekirdek konsantrasyonu düşük olabilir ve bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi için yeterince yüksek konsantrasyonlar sağlamak için peletin sadece 50 μL PBS çözeltisinde yeniden süspanse edilmesi önerilir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Sayma
<ol><li>Sayılacak her numune için, 1:3 seyreltme elde etmek için 10 μL çekirdek süspansiyonunu 20 μL PBS çözeltisi içinde seyreltin.</li>
	<li>Sayım için, floresan sayaç sayma plakasının bir karıştırma kuyucuğuna 25 μL propidyum iyodür (PI) boyama çözeltisi ekleyin. 25 μL seyreltilmiş çekirdek süspansiyonu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. 50 μL boyanmış numuneyi karıştırma kuyusundan yükleme kuyusuna aktarın.</li>
	<li>Sayma plakasını hücre sayacına yükleyin ve sayımı başlatın. NOT: Çekirdek sayısı, 700 ms'lik bir maruz kalma süresi ile kırmızı floresan kanalından alınır. Bu kanal, mikroskop altında bir Neubauer Odası ve Tripan Mavisi boyama ile manuel sayım ile çapraz karşılaştırma yaparak doğru bir çekirdek sayımı elde etmek için optimize edilmiştir. Yüksek konsantrasyonlarda, çekirdekler birbirine çok yakındır ve bu da yazılımın onları ayırmasını zorlaştırır. Bu durumda, numunenin uygun bir seyreltmede yeniden sayılması önerilir. Çekirdeklerin bütünlüğü ve temizliği, parlak alan görüntüsünden veya mikroskop altında değerlendirilebilir.</li>
	<li>Numuneleri PBS (0.2 U/μL'de 1x PBS + %0.04 BSA + RNaz inhibitörü) ile tek çekirdekli RNA dizilimi için istenen konsantrasyona seyreltin. NOT: 700-1.200 çekirdek/μL arasındaki konsantrasyonlar, tek çekirdekli RNA dizilimi için optimal kabul edilir. 700 çekirdek/μL gibi daha düşük hücre konsantrasyonları, ortamdaki RNA'dan arka plan kontaminasyonunun azalmasına neden olabilir.</li>
</ol>5. Kütüphane hazırlığı
<ol><li>Numune başına 8000-10.000 çekirdekli bir çekirdek geri kazanımını hedefleyen üreticinin protokolünü kullanarak tek hücreli gen ekspresyon reaktifleri ile tek çekirdekli RNA dizilimi gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Sıralama
<ol><li>Kitaplıkları eşleştirilmiş uç, çift indeksleme ve aşağıdaki sıralama okumaları ile istenen sıralama derinliğine sahip sıralayın: Okuma 1: 28 döngü, i7 İndeks: 10 döngü, i5 İndeks: 10 döngü ve Okuma 2: 90 döngü.</li>
</ol>

Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu ve Profillenmesi

<ol>
	<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Tissue+Dissociation+Protocol+for+Single-Cell+RNA+Sequencing+Analysis+of+Fresh+and+Cultured+Human+Skin+Biopsies.">An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).</li><li>Kimbley, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+optimized+methodologies+for+isolating+nuclei+from+esophageal+tissue.">Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue.</a> Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).</li><li>Maitra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+nuclei+from+archived+postmortem+tissues+for+single-nucleus+sequencing+applications.">Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).</li><li>Nadelmann, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+from+mammalian+cells+and+tissues+for+single-nucleus+molecular+profiling.">Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling.</a> Current Protocols. 1 (5), e132 (2021).</li><li>Rousselle, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+single+nuclei+isolation+from+clinical+biopsies+for+RNA-seq.">An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq.</a> Scientific Reports. 12, 9851 (2022).</li><li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors.">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li><li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing.">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901 (2021).</li><li>Alvarez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+from+human+snap-frozen+liver+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing.">Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Bio-Protocol. 13 (3), e4601 (2023).</li><li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus.">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).</li><li>Joshi, N., Misharin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+isolation+from+frozen+human+lung+tissue+for+single-nucleus+RNA-seq.">Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq.</a> Protocols.io. , (2019).</li><li>Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Frankenstein'+protocol+for+nuclei+isolation+from+fresh+and+frozen+tissue+for+snRNAseq.">'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq.</a> Protocols.io. , (2020).</li><li>Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+extraction+for+single-cell+RNAseq+from+frozen+tissue+using+Singulator&#8482;+100.">Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator&#8482; 100.</a> Protocols.io. , (2022).</li><li>Matson, K. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+spinal+cord+nuclei+for+massively+parallel+single-nucleus+RNA+sequencing.">Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413 (2018).</li><li>Mendelev, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+profiling+of+single+nuclei+from+frozen+archived+postmortem+human+pituitary+tissue.">Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue.</a> STAR Protocols. 3 (2), 101446 (2022).</li><li>Soule, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+nucleus+RNA-seq+from+frozen+skeletal+muscle.">A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle.</a> Life Science Alliance. 6 (5), e202201806 (2023).</li><li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types.">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648 (2018).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+single-cell+and+single-nucleus+RNA-sequencing+methods.">Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods.</a> Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomic+survey+of+cell+diversity+and+functional+maturation+in+postnatal+mammalian+hearts.">Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts.</a> Genes &amp; Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7, 6031 (2017).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq.">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542 (2020).</li><li>Jovanovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator&#8482; 100 and 200 systems. , (2022).</li><li>Bell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+high-throughput,+high-speed+and+high-precision+plate-based+image+cytometric+cell+counting+method.">Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method.</a> Cell &amp; Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).</li><li>Madler, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Besca,+a+single-cell+transcriptomics+analysis+toolkit+to+accelerate+translational+research.">Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102 (2021).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+single-cell+transcriptomic+response+of+murine+diabetic+kidney+disease+to+therapies.">Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies.</a> Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).</li><li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transcriptomic+atlas+of+the+non-human+primate+Macaca+fascicularis.">Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis.</a> Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).</li><li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung,+spleen,+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation.">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), 1 (2019).</li><li>Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ambient+RNA+contamination+causes+misinterpreted+and+masked+cell+types+in+brain+single-nuclei+datasets.">Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets.</a> Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Fleming, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsupervised+removal+of+systematic+background+noise+from+droplet-based+single-cell+experiments+using+CellBender.">Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX.">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biology. 21 (1), 57 (2020).</li><li>Young, M. D., Behjati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SoupX+removes+ambient+RNA+contamination+from+droplet-based+single-cell+RNA+sequencing+data.">SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data.</a> Gigascience. 9 (12), giaa151 (2020).</li></ol>

Tüm yazarlar çalışmanın yürütülmesi sırasında F. Hoffmann-La Roche çalışanıdır.

Donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli tek çekirdekler elde etmek için çok yönlü ve kısmen otomatik bir protokol geliştirdik ve protokolü fare beyni, sıçan böbreği ve sinomolgus karaciğer ve dalak dokusu üzerinde gösterdik.
Bu protokolün performansını beyin, böbrek, dalak ve karaciğer dokusunda tek çekirdekli RNA dizilimi için yayınlanmış diğer protokollerle karşılaştırdığımızda 6,7,20,24,25,26, çekirdek başına benzer sayıda gen ve UMI sayısını tespit edebildiğimizi ve beklenen hücre tiplerini geri kazanabildiğimizi gözlemliyoruz. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokolün çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, bu çalışmadaki protokol, doku homojenizasyonunu ve tek çekirdeklerin izolasyonunu otomatikleştirir. Bu, robotik bir doku bozucu21 kullanılarak elde edilir. Çoğu protokolde, tek çekirdekleri serbest bırakmak için doku bir Dounce homojenizatör ile homojenize edilir 3,20. Bununla birlikte, bu manuel adımın, homojenizasyon sırasında uygulanan kuvvet miktarına bağlı olarak çekirdek veriminde ve bütünlüğünde deneysel değişkenliğe yol açabileceğini ve deneylerin tekrarlanabilirliğini tehlikeye atabileceğini fark ettik. Burada, sabit ayarlara sahip otomatik bir doku öğütücü kullanılarak, deneyler arasında daha tutarlı bir şekilde iyi çekirdek kalitesi ve verimi elde edildi. Ayrıca, bu adımın otomatikleştirilmesi, protokolün uygulama süresini de azaltır (doku bozulma adımı yaklaşık 7 dakika sürer) ve kullanıcının sonraki adımlara hazırlanmasına olanak tanır. İkincisi, bu çalışmada açıklanan protokol çok yönlüdür, yani farklı türlerden farklı dokularla uyumludur. Bu, örneğin farklı dokular için homojenizasyon tamponlarını/deterjanlarını tanımlamak gibi uzun protokol optimizasyonundan kaçınmamızı sağlar 2,5,6. Üçüncüsü, bu protokol temiz çekirdekler elde etmek için bir akış sıralayıcıya erişime bağlı değildir, bu nedenle akış ayırma için gerekli ekipmana/uzmanlığa sahip olmayan laboratuvarlar için daha erişilebilir hale getirir. Bunun yerine, kalıntıların çoğunu temizlemek için sükroz gradyan tabanlı filtrelemeyi optimize ettik. Bununla birlikte, özellikle beyin dokusu için, daha verimli miyelin giderimi için sükroz gradyanı yerine silika kolloid gradyanı kullanılması önerilir. Ayrıca, sakaroz/silika kolloid gradyan santrifüjleme adımının sonunda sallanan kova rotorunun kullanılmasının çekirdek kaybını en aza indirdiğini bulduk. Bu nedenle, böyle bir rotorun kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Dördüncüsü, çekirdekleri saymak için birden fazla yöntemi test ettikten sonra (mikroskop altında manuel sayım, birkaç otomatik sayacın kullanımı), otomatik bir floresan hücre sayacının(22) kullanılması önerilir. Promidyum iyodür gibi bir DNA ara ayırıcı boyanın kullanılması, çekirdek sayımının doğruluğunu artırır. Beşincisi, bu protokol başlangıçtan mikroakışkan çipin yüklenmesine kadar yaklaşık 75 dakika sürer. Bu, birden fazla numuneyi işlerken çekirdek bütünlüğünün yüksek kalmasını sağlamaya yardımcı olur. Son olarak, protokolün optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) gömülü doku ile de uyumlu olduğunu bulduk. Bu tür bir malzeme kullanılıyorsa, doku homojenizasyondan önce bir neşter kullanılarak OCT bloğundan çıkarılabilir.
Tek çekirdekli RNA dizileme veri kümelerinde sık karşılaşılan bir zorluk, nükleer olmayan (örneğin mitokondriyal) ve nükleer kaynaklı olabilen ortam RNA'sının varlığıdır27,28. Protokolümüzde, mitokondriyal RNA (nükleer olmayan ortam RNA'sı için bir vekil) filtrelemeden önce bile düşüktür (gösterilen dokular için% 0.1-1.6). Bununla birlikte, diğer protokollere ve veri kümelerine benzer şekilde, bol hücre tiplerinin (karaciğerdeki hepatositler, beyinlerdeki nöronlar vb.) çekirdeklerinde yüksek oranda eksprese edilen genlerden ortam RNA kontaminasyonu hala mevcuttur27. Hücre Bükücü, SoupX, vb. gibi çeşitli biyoinformatik araçlar, çekirdek açıklamasındanönce bu tür ortam RNA kontaminasyonunu ortadan kaldırabilir 29,30,31. Bu protokolün bir başka sınırlaması, doku bozulması ve çekirdek izolasyon adımlarının otomatikleştirilmesine rağmen, bir seferde yalnızca bir numune işlenebildiğinden bu adımın veriminin hala sınırlı olmasıdır. Bununla birlikte, bu adım doku parçası başına yalnızca yaklaşık 7 dakika sürdüğünden, birden fazla numune yine de bir partide işlenebilir. Genellikle parti başına dört numune işliyoruz, ancak parti başına altı numuneye kadar iyi sonuçlar elde ettik. İki numunenin aynı anda paralel işlenmesine izin vermek için robotik ayrıştırıcıdaki son gelişmeler, parti başına 8-12 numunenin işlenmesini sağlayacaktır, bu da tek çekirdekli kapsülleme için kullanılan mikroakışkan çipin verimi ile uyumludur.
Bu protokol tarafından izole edilen çekirdekleri, diğer platformları kullanan ATAC-seq veya snRNAseq gibi diğer aşağı akış uygulamaları için kullanmamış olsak da, burada kullanılan gen ekspresyon reaktifleri ile elde edilen verilerin kalitesine bağlı olarak, protokolümüzün ek aşağı akış uygulamalarıyla uyumlu olması gerektiğine inanıyoruz. Bununla birlikte, gelecekteki çalışmalar, bu protokolün ATAC-seq gibi diğer aşağı akış uygulamalarıyla test edilmesini içerecektir.
Sonuç olarak, farklı tipteki donmuş memeli dokularıyla uyumlu olduğu gösterilen, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için hızlı, basit ve kısmen otomatik bir çekirdek izolasyon protokolü geliştirdik.

Tek hücreli (sc) ve tek çekirdekli (sn) RNA dizilimi, toplu RNA dizilimine kıyasla gen ekspresyonunun artan çözünürlüğü nedeniyle moleküler ve hücresel biyolojide yaygın olarak kullanılan protokoller haline gelmiştir. Bununla birlikte, katı dokulardan kaliteli tek hücreli ve tek çekirdekli preparatların izolasyonu bir zorluk olmaya devam etmektedir ve genellikle sc/sn-RNAseq deneylerinde hız sınırlayıcı adımdır. Gerçekten de, hücre/çekirdek süspansiyonlarını elde etmek için çeşitli kimyasal ve mekanik prosedürler kullanan çok sayıda protokol geliştirilmiştir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Ayrıca, bu tür preparatları döküntülerden/kümelerden vb. temizleme stratejileri, akış ayırmadan filtrelemeye ve yıkamaya kadar uzanır. Bu tür protokoller genellikle manueldir (kullanıcıyla ilgili değişkenliğe yol açar), zaman alıcı olabilir (hücre/çekirdek canlılığının azalmasına yol açar) ve/veya hücre/çekirdek sıralaması için bir akış sitometresine erişim gerektirebilir. Bu çalışma, aşağı akış RNA dizileme uygulamaları için donmuş memeli dokularından basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş tek çekirdekli bir izolasyon protokolü geliştirmeye odaklanmıştır. Dondurulmuş dokuların kullanımıyla uyumlu olduğu, numune toplamayı/işlemeyi daha pratik hale getirdiği ve özellikle zaman seyri deneylerinde numunelerin tarafsız bir şekilde harmanlanmasını sağladığı için hücre izolasyonunun aksine özellikle çekirdek izolasyonuna odaklandık. Ayrıca, nükleer transkriptom hücresel transkriptomu tam olarak yansıtmasa da, birkaç çalışma, hücre tiplerinin oranları değişebilse de, tek çekirdekli RNA dizileme verilerinin, hücre tipi tanımlaması için tek hücreli RNA dizileme verileriyle karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir 6,16,17,18,19.
Çekirdek izolasyonu birkaç adımdan oluşur: 1) çekirdekleri serbest bırakmak için dokunun mekanik veya kimyasal olarak bozulması, 2) döküntü ve kümelerin temizlenmesi ve 3) sonraki uygulamalara hazırlık için çekirdeklerin doğru sayımı. Bir dizi protokolde, adım 1, dokuyu 3,20 bozmak için sıklıkla bir Dounce homojenizatörünün kullanılmasını içerir. Alternatif olarak, kimyasal yöntemler kullanılabilir, ancak bunların genellikle farklı dokular için optimize edilmesi gerekir 2,5,6. Manuel bir doku bozma prosedürünün operatörle ilişkili değişkenliğe eğilimli olduğunu ve değişken kalite ve çekirdek verimine yol açtığını deneyimledik. Teknik değişkenliği en aza indirmek ve dokular arasında çalışan daha tutarlı ve tekrarlanabilir bir protokole sahip olmak için, ticari olarak temin edilebilen bir robotik doku ayrıştırıcısı kullanan bir protokol geliştirilmiştir21. Adım 2 için, tampon değişimi genellikle çekirdekleri yıkamak için en basit araç olsa da, döküntülerin daha kapsamlı bir şekilde uzaklaştırılması için nispeten kısa bir sükroz gradyan santrifüjleme adımının kullanımını benimsedik. Özellikle beyin dokusu için, daha etkili miyelin giderimi için sükroz gradyanı yerine silika kolloid gradyanı kullanıyoruz. Son olarak, sayım için, bir hemositometre kullanımı, çekirdekleri saymak ve görsel olarak incelemek için altın standarttır. Protokolümüzde bu adım, piyasada bulunan otomatik floresan hücre sayacı22 kullanılarak güvenilir bir şekilde otomatikleştirilebilir. Bu protokol test edilmiştir ve farklı memeli türlerinden (sıçan, fare ve insan olmayan primat) beyin, böbrek, dalak ve karaciğer dahil olmak üzere çeşitli donmuş memeli dokularıyla uyumludur ve damlacık tabanlı bir ticari platformla aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için kaliteli çekirdekler sağlar. Protokol, doku hazırlığından tek çekirdekli RNA dizileme iş akışının başlangıcına kadar yaklaşık 75 dakika sürer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9576_50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mM Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40U/&#956;l RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CELMXSYSF2</td>
			<td>Automated fluorescent cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000127</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Secondary Holder</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000129</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td>Single cell gene expression reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Library Kit v3.1 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000158</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39;GEM Kit v3.1 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000130</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Divided Polystyrene Reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-2000048</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Throughput Nexcelom Counting Plates</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHM24-A100-001</td>
			<td>Cell counter counting plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>2002840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Isolation Buffer</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>100-063-396</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Isolation Cartridge</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>100-063-287</td>
			<td>Precooled at 4 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NUC201-1KT</td>
			<td>Sucrose cushion solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NUC201-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Storage Reagent</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>100-063-405</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30124359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td>Silica colloid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNAse decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cell culture petri dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>330005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Aesculap AG</td>
			<td>BA210</td>
			<td>pre-cooled on dry ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit T Set A, 96 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000213</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singulator 100 System</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>-</td>
			<td>Commercially available robotic tissue dissociator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide 1M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>b23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaStain PI Staining Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CS1-0109-5mL</td>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer+A2:D44</td>
			<td>VWR</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, quick, and partially automated protocol for the isolation of single nuclei from frozen mammalian tissues for single nucleus sequencing

Tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi, sağladıkları transkriptomik bilgi zenginliği nedeniyle yaygın laboratuvar uygulamaları haline gelmiştir. Özellikle tek çekirdekli RNA dizilimi, ayrışması zor dokularda gen ekspresyonunu araştırmak için yararlıdır. Ayrıca, bu yaklaşım donmuş (arşiv) malzeme ile de uyumludur. Burada, ticari olarak temin edilebilen aletler ve reaktifler kullanılarak kısmen otomatik bir şekilde aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli tek çekirdekleri izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Spesifik olarak, doku homojenizasyonunu otomatikleştirmek ve standartlaştırmak için robotik bir ayrıştırıcı kullanılır, ardından çekirdekleri filtrelemek için optimize edilmiş bir kimyasal gradyan kullanılır. Son olarak, otomatik bir floresan hücre sayacı kullanarak çekirdekleri doğru ve otomatik olarak sayarız. Bu protokolün performansı fare beyni, sıçan böbreği ve sinomolgus karaciğer ve dalak dokusu üzerinde gösterilmiştir. Bu protokol basit, hızlıdır ve kapsamlı optimizasyon gerektirmeden çeşitli memeli dokularına kolayca uyarlanabilir ve aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için kaliteli çekirdekler sağlar.

Single-cell (sc) and single-nucleus (sn) RNA sequencing have become commonly used protocols in molecular and cellular biology due to the increased resolution of gene expression compared to bulk RNA sequencing. However, the isolation of good quality single cell and single nuclei preparations from solid tissues remains a challenge and is often the rate-limiting step in sc/sn-RNAseq experiments. Indeed, a plethora of protocols has been developed that use various chemical and mechanical procedures to obtain cell/nuclei suspensions1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Furthermore, strategies to clean up such preparations from debris/clumps, etc., range from flow sorting to filtration to washing. Such protocols are often manual (leading to user-related variability), can be time-consuming (leading to reduced cell/nucleus viability), and/or may require access to a flow cytometer for cell/nucleus sorting. This&#160;study focused on developing a simple, quick, and partially automated single nuclei isolation protocol from frozen mammalian tissues for downstream RNA sequencing applications. We focused specifically on nuclei isolation as opposed to cell isolation as it is compatible with the use of frozen tissues, rendering sample collection/processing more practical and enabling unbiased batching of samples, especially in time-course experiments. Furthermore, although the nuclear transcriptome does not fully reflect the cellular transcriptome, several studies have now shown that single nuclei RNA sequencing data is comparable to single cell RNA sequencing data for cell-type identification, even though the proportions of cell types can vary6,16,17,18,19.
Nuclei isolation consists of several steps: 1) mechanical or chemical disruption of the tissue to release the nuclei, 2) clean-up of debris and clumps, and 3) accurate counting of nuclei for preparation for downstream applications. In a number of protocols, step 1 frequently involves the use of a Dounce homogenizer in order to disrupt the tissue3,20. Alternatively, chemical methods can be used, although these often need to be optimized for different tissues2,5,6. We have experienced that a manual tissue disruption procedure is prone to operator-associated variability, leading to variable quality and yield of nuclei. In order to minimize technical variability and to have a more consistent and reproducible protocol that works across tissues, a protocol that uses a commercially available robotic tissue dissociator was developed21. For step 2, although buffer exchange is usually the simplest means for washing nuclei, we adopted the use of a relatively short sucrose gradient centrifugation step to have a more thorough removal of debris. For brain tissue specifically, we use a silica colloid gradient instead of a sucrose gradient&#160;for more effective myelin removal. Finally, for counting, the use of a hemocytometer is the gold standard for counting and visually inspecting the nuclei. In our protocol, this step can be reliably automated using a commercially available automated fluorescent cell counter22. This protocol has been tested and is compatible with several frozen mammalian tissues, including brain, kidney, spleen, and liver, from different mammalian species (rat, mouse, and non-human primate) and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing with a droplet-based commercial platform. The protocol takes approximately 75 min from tissue preparation to the start of the single nuclei RNA sequencing workflow.

Yazar Spotlight: İlaç Keşfinin Geliştirilmesi - Donmuş Dokulardan Çekirdek Ekstraksiyonu için Otomatik, Standartlaştırılmış Protokollerin Geliştirilmesi 

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

This research focuses on supporting drug discovery studies using single nuclei RNA sequencing to investigate the efficacy and safety of potential treatments. Therefore, we are developing standardized nuclei extraction protocols for fresh frozen tissue samples from various organs. Our goal was to automate and standardize nuclei extraction to achieve consistent and reliable results by reducing non-biological variability.The advantage is the partial automation through the use of a robotic dissociator and the simple and short workflow that can be applied on various tissue samples of different species. Having standardized protocols can help us answer questions about drug biodistribution, as well as explore the mechanisms underlying any safety signals that we might observe. In the future, we will be testing the applicability of our protocol for other downstream applications, such as ATAC-seq or multiomics.We will also try to establish protocols to detect virally expressed transgenes in single nuclei.

Bu protokolün performansı ve çok yönlülüğü, üç B6 faresinden alınan taze donmuş beyin oksipital korteks dokusu, üç Wistar sıçanından alınan taze donmuş enine kesilmiş böbrek dokusu, üç Mauritius Cynomolgus makakından alınan arşiv (11 yaşındaki) karaciğer ve dalak dokusu üzerinde tek çekirdekli RNA dizilimi gerçekleştirilerek gösterilmiştir. Tüm hayvanlar perfüze edilmemiştir.
Şekil 1B,C'de gösterildiği gibi, kanama, döküntü ve topaklanma belirtileri olmayan kaliteli çekirdekler elde edildi. Sükroz gradyan tabanlı filtrasyon, farklı yoğunlukları, dönüş hızlarını ve süreleri test ederek ve nükleer saflığı/bütünlüğü mikroskop altında değerlendirerek ve ayrıca çekirdek boyutu dağılımını ve verimini değerlendirerek döküntülerin çoğunu gidermek için optimize edildi (Şekil 1D). Bu, 1,5 M'lik bir sükroz gradyan yoğunluğu seçmemize ve 15 dakikalık kısa bir sıkma süresi kullanmamıza izin verdi. Daha sonra, çekirdeklerin kalitesini daha fazla değerlendirmek için, veriler 10X Cell Ranger kullanılarak önceden işlendi ve Besca23 kullanılarak daha fazla aşağı akış veri analizi gerçekleştirildi. Yüzde >5 mitokondriyal içeriğe sahip çekirdekler (bunlar hasarlı/stresli çekirdekler olma eğiliminde olduğundan) filtrelendi ve 500-7.000 gen içeren çekirdekler (boş damlacıkları ve çoklukları en aza indirmek için) tutuldu. Sadece en az 30 çekirdekte bulunan genleri dahil ettik. Beyin korteks örneği başına 8,000 çekirdeği ve böbrek, karaciğer ve dalak örneği başına 10,000 çekirdeği hedefledik. Filtrasyondan sonra, üç beyin örneğinden 10.644 yüksek kaliteli çekirdek, üç böbrek örneğinden 14.960 yüksek kaliteli çekirdek, üç karaciğer örneğinden 18.795 yüksek kaliteli çekirdek ve üç dalak örneğinden 13.882 yüksek kaliteli çekirdek elde edildi. Şekil 2A,D,G,J, her numunedeki UMI sayılarının, gen sayımlarının ve mitokondriyal içeriğin dağılımını temsil eden keman grafiklerini göstermektedir. Tüm beyin örneklerinde medyan sayım sayısı 7.563 UMI / çekirdek ve 3.208 gen / çekirdek idi. Tüm böbrek örneklerinde medyan sayım sayısı 3.841 UMI / çekirdek ve 1.915 gen / çekirdek idi. Tüm karaciğer örneklerinde medyan sayım sayısı 2.649 UMI / çekirdek ve 1.676 gen / çekirdek idi. Tüm dalak örneklerinde medyan sayım sayısı 1.609 UMI / çekirdek ve 1.138 gen / çekirdek idi. Daha sonra oldukça değişken genler kullanarak kümeler oluşturduk ve bilinen işaretleyici genler 17,24,25,26'yı kullanarak bunları açıkladık. Şekil 2B,E,H,K'de görüldüğü gibi, her dokudan beklenen hücre tiplerini belirleyebildik. Ayrıca, Şekil 2B, E, H, K'de görüldüğü gibi, tüm hayvanlar tüm kümelere katkıda bulundu ve bu da protokol tarafından getirilen genel düşük teknik değişkenliği gösterdi. Ayrıca, hücresel oranlar, UMI ve gen sayıları gibi doku tipi başına her üç örnekte de karşılaştırılabilirdi (Şekil 2A, C, D, F, G, I, J, L). Dikkate değer bir istisna, üç karaciğer örneği arasındaki hepatosit popülasyonlarının oranlar ve profil bakımından farklı olduğu karaciğerdir. Bu büyük olasılıkla hayvanlar arasındaki biyolojik farklılıklardan (cinsiyet, yaş, metabolik durum) kaynaklanmaktadır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig01.jpg"> Şekil 1: Çekirdek kalitesinin değerlendirilmesi ve sükroz gradyan optimizasyonu. (A) Sükroz gradyan santrifüjlemesi sırasında beklenen faz ayrımı bir okla gösterilir. (B) Protokol ile elde edilen propidyum iyodür ile boyanmış sıçan böbreği (üstte) ve sinomolgus dalak (altta) çekirdeklerinin temsili floresan görüntüleri. (C) Fare karaciğerinden (üstte) ve fare beyninden (altta) izole edilen çekirdeklerin temsili parlak alan mikroskobu görüntüleri, ölçek çubuğu 500 μm. Çekirdeklerin düzenli pürüzsüz yüzeyine dikkat edin, bu da iyi nükleer kaliteyi gösterir. (D) Sükroz gradyan optimizasyonu. Birkaç sükroz yoğunluğu, sıkma hızı ve sıkma süresi test edildi. Her koşul için çekirdeklerin, çekirdek boyutu dağılımının ve çekirdek veriminin parlak alan mikroskobu görüntüleri gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig02.jpg"> Şekil 2: snRNAseq'ten fare beyni oksipital korteksi, sıçan böbreği (korteks ve medulla) ve sinomolgus makak karaciğeri ve dalağı hakkındaki temsili veriler. (A) Beyin örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI'lerin/çekirdeğin ve mitokondriyal içeriğin yüzdesini gösteren keman grafikleri. (B) Sol panel: Her bir numunenin beyinde tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Beyin dokusundaki işaretleyici genlere dayalı olarak açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (C) 3 beyin örneğinde gözlenen hücresel oranlar. (D) Böbrek örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI'lerin/çekirdeğin ve yüzde mitokondriyal içeriğin dağılımını gösteren keman grafikleri. (E) Sol panel: Her bir numunenin böbrekte tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Böbrek dokusundaki belirteç genlerine göre açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (F) 3 böbrek örneğinde gözlenen hücresel oranlar. (G) Karaciğer örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI'lerin/çekirdeğin ve yüzde mitokondriyal içeriğin dağılımını gösteren keman grafikleri. (H) Sol panel: Her bir numunenin karaciğerde tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Karaciğer dokusundaki işaretleyici genlere dayalı olarak açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (I) 3 karaciğer örneğinde gözlenen hücresel oranlar. (J) Dalak örneği başına genlerin/çekirdeğin, UMI'lerin/çekirdeğin ve mitokondriyal içeriğin yüzdesini gösteren keman grafikleri. (K) Sol panel: Her bir numunenin dalakta tanımlanan kümelere katkısını gösteren UMAP grafiği. Sağ panel: Dalak dokusundaki işaretleyici genlere göre açıklamalı kümelerin kimliklerini gösteren UMAP. (L) 3 dalak örneğinde gözlenen hücresel oranlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Numune başına hacim</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Sükroz Yastık Çözümü</td>
			<td>2 AYLIK</td>
			<td>1500 μL</td>
			<td>1,5 milyon</td>
		</tr><tr><td>Sükroz Yastık Tamponu</td>
			<td>-</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td>
			<td>1 AYLIK</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>1 milyon</td>
		</tr><tr><td>RNAse inhibitörü</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: 1.5 M sükroz yastık çözeltisinin (SCS) hazırlanması. Bu çözelti, adım 3.1'deki temizlik sırasında sükroz gradyan santrifüjlemesi için kullanılır ve protokole başlamadan önce her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Protokol sırasında SCS'yi her zaman buzda tutun. Bu tabloda belirtilen çözümlere Malzeme Tablosunda atıfta bulunulmaktadır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Numune başına hacim</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Silika kolloid stok çözeltisi</td>
			<td>90%</td>
			<td>600 μL</td>
			<td>18%</td>
		</tr><tr><td>Çekirdek Depolama Reaktifi (S2 Genomik)</td>
			<td>-</td>
			<td>2400 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>RNAse inhibitörü</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2:% 18 silika kolloid çözeltisinin hazırlanması. Bu çözelti, adım 3.2'deki temizlik sırasında silika kolloid gradyan santrifüjlemesi için kullanılır ve protokole başlamadan önce her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır. Protokol sırasında her zaman% 18 silika kolloid çözeltisini buz üzerinde tutun.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Doku</td>
			<td>Numune ağırlığı</td>
			<td>Fişek</td>
			<td>Rekolte</td>
		</tr><tr><td>Sıçan karaciğeri</td>
			<td>25 mg</td>
			<td>Çekirdek İzolasyon Kartuşu</td>
			<td>mg doku başına 65.000 çekirdek</td>
		</tr><tr><td>Sıçan karaciğeri</td>
			<td>4 mg</td>
			<td>Küçük Giriş Çekirdekleri İzolasyon Kartuşu</td>
			<td>mg doku başına 32.000 çekirdek</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Sükroz gradyan temizleme sonrası düşük girişli çekirdek izolasyon kartuşundan çekirdek verimi, çekirdek izolasyon kartuşuna karşı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Numune başına hacim</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Çekirdek Depolama Reaktifi</td>
			<td>-</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>RNAse inhibitörü</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: Çekirdek depolama reaktifinin (NSR) hazırlanması. Bu çözüm, 3-5. adımlardaki Çekirdek İzolasyonu sırasında ve 3.1.8. adımdaki temizleme sırasında kullanılır. 4 °C'de 4 aya kadar saklanabilir. Temizleme adımı 6'daki santrifüj adımı sırasında RNase inhibitörü ile taze bir alikot hazırlayın. Bu tabloda belirtilen çözümlere Malzeme Tablosunda atıfta bulunulmaktadır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">1x PBS + %0,04 BSA hisse senedi çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>Stok hacmi</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>PBS (Ca2+ yok, Mg2 + yok)</td>
			<td>1 adet</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td>
			<td>30%</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>0.04%</td>
		</tr><tr><td colspan="4">1x PBS +% 0.04 BSA + 0.2 U / μL RNA inhibitörü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>Numune başına hacim</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>1x PBS + %0,04 BSA Hisse Senedi Çözümü</td>
			<td>-</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>RNAse inhibitörü</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 5: PBS + %0.04 BSA'nın hazırlanması. Bu çözelti, adım 3.1.10'daki temizlemenin sonunda ve sayımdan sonra, 10X tek çekirdekli RNA dizilimi için çekirdek süspansiyonunu istenen konsantrasyona seyreltmek için kullanılır (sayım adımı 4.4). Stok çözelti 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir. Temizleme adımı 6'daki santrifüj adımı sırasında RNase inhibitörü ile taze bir alikot hazırlayın.

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Drug Discovery - Development of Automated, Standardized Protocols for Nuclei Extraction from Frozen Tissues at JoVE.com

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they ...

Bu araştırma, potansiyel tedavilerin etkinliğini ve güvenliğini araştırmak için tek çekirdekli RNA dizilimi kullanan ilaç keşif çalışmalarını desteklemeye odaklanmaktadır. Bu nedenle, çeşitli organlardan alınan taze donmuş doku örnekleri için standartlaştırılmış çekirdek ekstraksiyon protokolleri geliştiriyoruz. Amacımız, biyolojik olmayan değişkenliği azaltarak tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmek için çekirdek ekstraksiyonunu otomatikleştirmek ve standartlaştırmaktı.Avantajı, robotik bir ayrıştırıcı kullanımı yoluyla kısmi otomasyon ve farklı türlerden çeşitli doku örneklerine uygulanabilen basit ve kısa iş akışıdır. Standartlaştırılmış protokollere sahip olmak, ilaç biyodağılımı ile ilgili soruları yanıtlamamıza ve gözlemleyebileceğimiz herhangi bir güvenlik sinyalinin altında yatan mekanizmaları keşfetmemize yardımcı olabilir. Gelecekte, protokolümüzün ATAC-seq veya multiomik gibi diğer aşağı akış uygulamaları için uygulanabilirliğini test edeceğiz.Ayrıca, tek çekirdeklerde viral olarak eksprese edilen transgenleri tespit etmek için protokoller oluşturmaya çalışacağız.

a-simple-quick-partially-automated-protocol-for-isolation-single

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

2.8K Görüntüleme.  Roche Innovation Centre Basel. Bu araştırma, potansiyel tedavilerin etkinliğini ve güvenliğini araştırmak için tek çekirdekli RNA dizilimi kullanan ilaç keşif çalışmalarını desteklemeye odaklanmaktadır. Bu nedenle, çeşitli organlardan alınan taze donmuş doku örnekleri için standartlaştırılmış çekirdek ekstraksiyon protokolleri geliştiriyoruz. Amacımız, biyolojik olmayan değişkenliği azaltarak tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmek için çekirdek ekstraksiyonunu otomatikleştirmek ve...

Video: Yazar Spotlight: İlaç Keşfinin Geliştirilmesi - Donmuş Dokulardan Çekirdek Ekstraksiyonu için Otomatik, Standartlaştırılmış Protokollerin Geliştirilmesi 

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Biyoloji

Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nuclei RNA Sequencing

To begin, start the robotic dissociator. Turn on the cooling by setting the slider at the top of the right of the screen to Cool, and clicking on it to start cooling so that the slider appears orange. Next, check that the attached NSR and NIB bottles have sufficient liquid and are properly cooled.Remove the tissue samples from the minus 80 degrees Celsius freezer, and immediately place them on dry ice. Using a pre-cooled scalpel, cut the tissue into a 15 to 50 milligram piece on a pre-cooled Petri dish, or metal plate, placed on dry ice. Remove the nuclei isolation cartridge from the refrigerator and unpack it.Remove the grinder, and pipette 15 microliters of RNAs inhibitor to the bottom of the cartridge. Using tweezers, place the tissue sample at the bottom of the cartridge. Next, select Run a Protocol on the instrument, and click on the Nuclei option in the upper left corner.From the menu, select the Low Volume Nuclei isolation protocol, and then click on Modify to verify that the disruption speed is set to fastest. Then, open the instrument door. Insert the cartridge into the designated location.Rotate the cartridge lock, and slide into the stage until the red knob clicks into place. Close the door and click Next to start the nuclei extraction run. Once the run is finished, remove the cartridge from the instrument by lifting the red knob and pulling out the stage.Immediately place the cartridge on ice.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu

Clean-Up and Counting of Isolated Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues

After isolating single nuclei from frozen mammalian tissues, carefully pierce the round foil on the dissociator cartridge using a pipette tip. To facilitate sucrose gradient cleanup, remove 900 microliters of the nuclei suspension from the cartridge and add it to 500 microliters of sucrose cushion solution or SCS prepared in a two milliliter tube. Mix well by pipetting until the mixture is homogenous.Next, hold the tube at an angle, and carefully add 1, 400 microliters of nuclei suspension SCS mixture drop-wise onto a new 500 microliters of SCS, creating a clearly visible phase separation. Carefully close the tube, and place it back on the ice without disturbing the phase separation. Carefully spin the tubes at 13, 000g for 15 minutes at four degrees Celsius in a pre-cooled centrifuge.Remove the supernatant without disturbing the palette, and carefully resuspend the palette in 50 microliters of ice-cold NSR. Pull the two palettes of the same sample in a new 1.5 milliliter tube. Add 900 microliters of ice-cold NSR to a total volume of one milliliter, and mix well by pipetting.Centrifuge the sample at 500g for five minutes at four degrees Celsius with a swinging bucket rotor centrifuge. Remove the supernatant and resuspend the pellet in 100 microliters of PBS. For counting, dilute 10 microliters of nuclei suspension in 20 microliters of PBS.Add 25 microliters of propidium iodide staining solution to a mixing well of the fluorescent counter counting plate. Then add 25 microliters of diluted nuclei suspension, and mix well by pipetting. Transfer 50 microliters of the stained sample from the mixing well to the loading well.Load the counting plate on the cell counter and start the count. After counting, dilute the samples with PBS to the desired concentration for single nuclei RNA sequencing. Using the partially automated nuclei isolation protocol, good quality nuclei were obtained without signs of blabbing, debris or clumping.Violin plots representing the distribution of gene counts, UMI counts and mitochondrial content in each sample are shown. Expected cell types from each tissue were identified, and all animals contributed to all clusters, indicating low technical variability introduced by the protocol. Furthermore, cellular proportions, UMI counts and gene counts were comparable across all three samples per tissue type.