Os autores gostariam de agradecer ao Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant No. 2021YFD2200502), à National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) pelo apoio financeiro.

1. Preparo de mudas de bambu
<ol><li>Preparar mudas de bambu moso (Phyllostachys edulis) usando sementes colhidas em Guilin, Guangxi, China. Comece mergulhando as sementes em água por 2-3 dias, certificando-se de trocar a água diariamente. Em seguida, crie um substrato misturando solo e vermiculita em uma proporção de 3:1.</li>
	<li>Semear as sementes embebidas no substrato para germinação. Manter as mudas em condições de laboratório, mantendo a temperatura entre 18-25 °C. Garanta um fotoperíodo claro/8 h escuro de 16 h com uma intensidade de luz de 250-350 μmol/m2/s durante a fase de luz.</li>
	<li>Manter uma umidade relativa do ar de aproximadamente 60%. Para a infecção por Agrobacterium, utilize mudas com 15 dias de vida e altura de 2 a 10 cm, que é o melhor estágio para transformação. NOTA: Como a floração do bambu é imprevisível, as sementes não estão disponíveis todos os anos. As sementes são geralmente armazenadas por 2-3 anos a 4 °C em ambiente seco e ainda podem manter uma viabilidade de mais de 20%.</li>
</ol>2. Preparação de plasmídeos e Agrobacterium
<ol><li>Plasmídeos: Para validar o efeito de expressão transitória, empregar a construção pHDE-35S::RUBY contendo um gene repórter visível conduzido pelo promotor CaMV 35S 10. Para a edição de genes, use a construção pCambia1300-Ubi::Cas9, que carrega o gene Cas9 impulsionado pelo promotor Ubi de milho11. Insira as sequências guiadas de sgRNA de PeVDE e outros genes alvo entre os dois sítios AarI na construção pCambia1300-Ubi::Cas9 9.</li>
	<li>Insira as sequências de RNA-guia CRISPR/Cas9 entre os dois sítios de endonuclease de restrição AarI da construção pCambia1300-Ubi::Cas9 , incluindo os genes-alvo PeVDE e PeCCR5 .</li>
	<li>Adicione GGCA à extremidade 5' da sequência de 20 nucleotídeos e sintetize uma sequência de DNA de fita simples. Complemente reversamente a sequência de 20 nucleotídeos e adicione AAAC à extremidade 5' e, em seguida, sintetize outra sequência de DNA de fita simples.</li>
	<li>Diluir ambas as sequências de ADN de fita simples até uma concentração de 10 nM/L em água diluída, misturar cuidadosamente e aquecer a 95 °C durante 5 minutos. Deixe a mistura arrefecer até à temperatura ambiente, resultando na formação de adaptadores de fita dupla.</li>
	<li>Conecte os adaptadores com o fragmento linear pCambia1300-Ubi::Cas9 digerido pela endonuclease AarI usando T4 DNA ligase e sequencie o vetor CRISPR/Cas9 construído para obter a construção desejada de direcionamento gênico.</li>
	<li>Para transformar plasmídeos em Agrobacterium, use o método de congelamento-descongelamento da seguinte forma: Misture 1 μL dos plasmídeos (concentração: 10 - 1.000 ng/μL) com 100 μL de células competentes em Agrobacterium (eficiência de tradução: > 1 x 104 unidades formadoras de colônias/μg) e misture-os suavemente. Coloque a mistura no gelo por 5 min. Transfira a mistura para nitrogênio líquido por 5 min.</li>
	<li>Descongelar a mistura em banho-maria a 37 °C durante 5 min. Adicionar 500 μL de meio Luria-Bertani (LB) à mistura e incubá-la numa incubadora de agitação a 28 °C a 200 rpm durante 2-3 h. Para os plasmídeos pHDE-35S::RUBI, introduzi-los individualmente nas cepas AGL1, GV3101, LBA4044 e EHA105 de Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)12. Para os plasmídeos CRISPR/Cas9, introduzi-los na cepa GV3101 de A. tumefaciens.</li>
	<li>Cultivar Agrobacterium em meio de peptona de extrato de levedura (YEP) (10 g de extrato de carne bovina, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl por L) com os antibióticos correspondentes (espectinomicina para 35S::RUBI e canamicina para CRISPR/Cas9) a 28 °C. As colônias únicas foram observadas 36-48 h após o cultivo.</li>
	<li>Colher e transferir as colônias para o meio líquido YEP (com antibióticos correspondentes) para crescimento posterior. Após 24-36 h, utilizar os primers de RUBY-F e RUBY-R (Tabela 1) para realizar a PCR para confirmar o sucesso na transferência de plasmídeos para Agrobacterium.</li>
	<li>Transfira 1 mL da Agrobacterium transformada com sucesso em 100 mL de meio YEP líquido fresco (com antibióticos correspondentes) e cresça durante a noite a 28 °C para um OD600 de 0,8.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão bacteriana a 4.000 x g por 5 min a 4 °C, lavar o pellet bacteriano uma vez com meio de infiltração de suspensões (10 mM MgCl2 e 10 mM MES-KOH [pH 5,6]) e, em seguida, centrifugar novamente. Ressuspender o pellet bacteriano em meio de infiltração em suspensão para um OD600 de 0,6 para transformação de bambu.</li>
</ol>3. Agrobacterium - mediado em sistema de transformação de plantas
<ol><li>Preparar-se para a transformação; Remova cuidadosamente as mudas com raízes aderidas ao solo do substrato, garantindo que as raízes permaneçam intactas. Embrulhe as mudas com papel alumínio para manter a umidade e evitar o desprendimento do solo (Figura 1A).</li>
	<li>Transferir as mudas embaladas para um ambiente com maior umidade (umidade relativa do ar >90%) e menor iluminação (intensidade inferior a 50 μmol/m 2/s) por uma duração de2 h.</li>
	<li>Usando uma agulha afiada de uma seringa, enrole a parte superior das folhas imaturas enroladas (aproximadamente 1-2 cm do topo) das mudas de bambu uma ou duas vezes (como indicado pelos triângulos vermelhos na Figura 1A).</li>
	<li>Depois, mergulhe a parte superior ferida das mudas em suspensões de Agrobacterium. Realize todo o processo, desde o ferimento até o mergulho em Agrobacterium rapidamente, pois a ferida fresca aumentará a eficiência da inoculação.</li>
	<li>Transferir imediatamente as mudas para uma câmara de vácuo com pressão de 25-27 mmHg por 2 min (Figura 1B).</li>
	<li>Após aspirar, desembrulhe cuidadosamente as mudas e replante-as no substrato. Colocar as plântulas em luz fraca ou escuro (<50 μmol/m 2/s) com alta umidade (UR >90%) à temperatura ambiente (18-25 °C) por2 dias. Posteriormente, cultivar as mudas em condições normais de crescimento, regando-as a cada 5-7 dias. Observe seus fenótipos para fornecer materiais para experimentos subsequentes.</li>
</ol>4. Projetando RNAs guia único (sgRNAs) para edição de genes
<ol><li>Identificar um sítio de motivo adjacente (PAM) do protoespaçador localizado perto de um domínio específico e conservado da sequência do gene alvo. Certifique-se de que a sequência PAM específica seja NGG neste sistema CRISPR/Cas9. Verifique a especificidade no alvo da sequência selecionada realizando uma pesquisa BlastN no banco de dados do genoma de bambu. Garantir que o sgRNA seja único, especialmente na região a montante e próximo ao PAM 9,11. NOTA: Esta comparação reduzirá efetivamente potenciais locais fora do alvo no genoma afetados pelo processo de edição genética.</li>
	<li>Projetar dois sgRNAs (sgRNA-1 e sgRNA-2) no primeiro exon do gene PeVDE 13. Incluir sítios de restrição de IdadeI a montante do PAM no sgRNA-1 e sítios de restrição do XbaI a montante do PAM no sgRNA-2. Projetar um sgRNA no quarto exon do gene PeCCR5 , que codifica o motivo conservado de KNWYCYGK. Este motivo é crítico para a catálise de CCRs14.</li>
	<li>Projete uma sequência de espaçadores de 20 nucleotídeos adjacente ao sítio PAM. Esta sequência espaçadora guiará a enzima Cas9 até o local alvo para clivagem do DNA e posterior edição gênica. NOTA: É aconselhável escolher uma região alvo a montante do sítio de clivagem da enzima endonuclease dentro do sítio PAM. Isso facilitará a validação da eficiência da edição de genes.</li>
</ol>5. Design do primer e PCR
<ol><li>Projetar manualmente primers específicos para amplificação dos fragmentos PeVDE e PeCCR5 . Projete os primers a montante e a jusante para que estejam localizados pelo menos 100 pb fora do local alvo, com uma diferença de comprimento de mais de 100 pb para permitir a separação de bandas distintas durante a eletroforese. Projetar primers para amplificação de RUBY dentro dos primeiros 500 pb do gene. A lista de todos os primers utilizados é fornecida na Tabela 1.</li>
	<li>Use uma DNA polimerase de alta fidelidade para PCR. Neste caso, utilizar DNA polimerase com alta fidelidade e eficiente amplificação na clonagem gênica.</li>
	<li>Preparar a mistura de reação de PCR da seguinte forma: tampão 5x (Mg2+ Plus): 4 μL; Mistura de dNTP (2,5 mM cada): 1,6 μL; Iniciadores para frente e para trás (10 pmol cada): 1 μL cada; DNA do genoma do bambu (aproximadamente 50 ng); DNA Polimerase (2,5 U/μL): 0,2 μL; Diluir a água até um volume total de 20 μL.</li>
	<li>Siga as condições de funcionamento do PCR: Desnaturação inicial a 98 °C por 5 min; Desnaturação a 98 °C por 10 s; Recozimento a 56 °C por 5 s; Extensão a 72 °C por 30 s; Repetir a desnaturação para extensão por 32 ciclos; Extensão final a 72 °C por 5 min; Mantenha a 4 °C indefinidamente. NOTA: As condições de PCR são fornecidas como exemplo e podem precisar ser otimizadas para aplicativos ou destinos específicos.</li>
</ol>6. Extração de DNA, digestão da enzima endonuclease e sequenciamento
<ol><li>Separe a região com valores mais baixos de NPQ das lâminas frescas das folhas de bambu usando tesoura, conforme identificado pelo fluorômetro de imagem PAM (consulte o passo 7.4). Congelar as amostras de folhas com nitrogênio líquido e transferir as amostras de folhas congeladas para uma argamassa. Triture as amostras em um pó fino usando um pilão, adicionando nitrogênio líquido suficiente durante o processo de moagem. Essa etapa ajuda na liberação do conteúdo celular, incluindo o DNA.</li>
	<li>Extrair DNA genômico da folha em pó usando o método de Brometo de Amônio Cetiltrimetilamônio (CTAB). Adicionar 50 mg de amostras de pó de folhas a 800 μL de uma solução de CTAB a 2%. Misturar bem a amostra e incubar a 65 °C durante 30 minutos, agitando suavemente de 5 em 5 minutos.</li>
	<li>Adicionar um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1, v/v) e agitar vigorosamente a mistura. Após centrifugação a 8.000 g por 8 min, transferir o sobrenadante para um novo tubo.</li>
	<li>Adicionar um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico e repetir o passo 6.3. Adicionar um volume igual de isopropanol gelado e inverter o tubo várias vezes antes de ser colocado a -20 °C durante 30 minutos. Após centrifugação a 8.000 x g por 5 min, descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lavar o pellet de ADN 2x com etanol a 75% a 4 °C e, em seguida, dissolver em 50 μL de água.</li>
	<li>Amplificar o DNA genômico contendo o local alvo dos genes-alvo de folhas de bambu selvagens e infectadas por Agrobacterium com o protocolo na etapa 5.4.</li>
	<li>Realizar a digestão da enzima endonuclease dos produtos da PCR. Selecione uma enzima específica que reconheça os locais de restrição desejados dentro dos fragmentos de DNA amplificados. Use endonucleases AgeI e XbaI para digestão.</li>
	<li>Preparar uma mistura de reacção constituída por IdadeI ou XbaI (20 unidades/μL)- 1 μL, 1 μg de produtos de PCR, 10x tampão - 5 μL, e adicionar água a um volume total de 50 μL. Incubar a 37 °C durante 1 h.</li>
	<li>Analisar a proporção de fragmentos de DNA digeridos por eletroforese em gel. Compare os fragmentos digeridos das amostras selvagens e infectadas por Agrobacterium para avaliar a eficiência da edição de genes.</li>
	<li>Marcar as sequências do adaptador transposase TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG e GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG na extremidade 5' dos primers forward e reverse, respectivamente, para amplificação dos fragmentos PeVDE e PeCCR5 9,15. Utilizar o protocolo descrito na etapa 5.4 para amplificação. Preparar os produtos de PCR (antes da digestão) para sequenciamento profundo.</li>
</ol>7. Medição da fluorescência da clorofila dos valores de NPQ em folhas
<ol><li>Previamente às medidas, expor as mudas de bambu a condições de alta intensidade luminosa de 1200 μmol/m 2/s por2 h. Essa exposição aumenta a quantidade de luz absorvida quântica e ativa o sistema de fotoproteção nas folhas.</li>
	<li>Use um fluorômetro de imagem PAM para medir a fluorescência in vivo da clorofila PS II de folhas de bambu. Ajuste a intensidade da luz actínica para 800 μmol/m2/s para medições de fluorescência de 6 min. Durante este período, aplicar um pulso de saturação a cada 30 s para obter curvas de fluorescência da clorofila. Os valores estáveis das curvas serão utilizados para os cálculos13.</li>
	<li>Calcule a têmpera não fotoquímica (NPQ) usando a fórmula: NPQ = (F m - F m') / F m' onde F m representa a fluorescência máxima no estado adaptado ao escuro, e Fm' representa a fluorescência máxima em qualquer estado adaptado à luz.</li>
	<li>Monitore os valores de NPQ a partir da interface visual do software de imagem. O software permite a análise em tempo real e a exibição dos dados de fluorescência, incluindo os valores de NPQ.</li>
</ol>

Desenvolvendo métodos de transformação e edição de genes em bambu

<ol>
	<li>Jiang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+plant+regeneration+and+transformation+system+of+ma+bamboo+(Dendrocalamus+latiflorus+Munro)+started+from+young+shoot+as+explant.">An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+CRISPR/Cas9+mediated+genome+editing+and+its+application+in+manipulating+plant+height+in+the+first+generation+of+hexaploid+Ma+bamboo+(Dendrocalamus+latiflorus+Munro).">Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro).</a> Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).</li><li>Xiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+purple+Ma+bamboo+(Dendrocalamus+latiflorus+Munro)+with+enhanced+drought+and+cold+stress+tolerance+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis.">Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis.</a> Planta. 254 (3), 50 (2021).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genetic+transformation+and+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+system+for+moso+bamboo+(Phyllostachys+edulis).">An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).</li><li>Lee, M. W., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+assay+by+agroinfiltration+of+leaves.">Transient expression assay by agroinfiltration of leaves.</a> Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).</li><li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+systems+in+plants:+potentialities+and+constraints.">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+and+expedient+screening+of+CRISPR/Cas9-mediated+non-transgenic+mutant+plants.">A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants.</a> Horticulture Research. 5, 13 (2018).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+biotechnology+for+in-planta+gene+editing+and+its+application+in+promoting+flavonoid+biosynthesis+in+bamboo+leaves.">A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves.</a> Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).</li><li>He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+for+noninvasively+monitoring+gene+expression+and+plant+transformation.">A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation.</a> Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).</li><li>Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+CRISPR/Cas9+system+for+multiplex+genome+editing+in+rice.">A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).</li><li>McCormick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+disc+transformation+of+cultivated+tomato+(L.+esculentum)+using+Agrobacterium+tumefaciens.">Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).</li><li>Lou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+violaxanthin+de-epoxidase+gene+from+moso+bamboo,+confers+photoprotection+ability+in+transgenic+Arabidopsis+under+high+light.">a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).</li><li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cinnamoyl+CoA+reductases+involved+in+parallel+routes+to+lignin+in+Medicago+truncatula.">Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).</li><li>De Roeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+ABCA7+mutations+and+transcript+rescue+mechanisms+in+early+onset+Alzheimer's+disease.">Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).</li></ol>

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Este método reduz significativamente o tempo necessário em comparação com os métodos tradicionais de transformação genética, que normalmente levam 1-2 anos, e alcança a expressão transitória de genes exógenos e edição gênica de genes endógenos dentro de 5 dias. No entanto, este método tem limitações, pois só pode transformar uma pequena proporção de células, e as folhas editadas por genes são quiméricas e não têm a capacidade de se regenerar em plantas completas. No entanto, esta tecnologia de ...

A investigação da função gênica no bambu é uma grande promessa para a compreensão avançada do bambu e para o desvendamento de seu potencial de modificação genética. Uma maneira eficaz disso pode ser alcançada através do processo de infecção mediada por Agrobacterium em folhas de bambu, pelo qual o fragmento de T-DNA contendo genes exógenos é introduzido nas células, levando posteriormente à expressão dos genes dentro das células foliares.
O bambu é um recurso valioso e renovável com uma ampla gama de aplicações na fabricação, arte e pesquisa. O bambu possui excelentes propriedades da madeira, como alta resistência mecânica, tenacidade, rigidez moderada e flexibilidade1, que agora é amplamente utilizado em uma variedade de suprimentos domésticos e industriais, incluindo escovas de dentes, canudos, botões, louças descartáveis, tubulações subterrâneas e enchimentos de torre de resfriamento para geração de energia térmica. Portanto, a criação de bambu desempenha um papel crucial na obtenção de variedades de bambu com excelentes propriedades de madeira para substituir plásticos e reduzir o uso de plástico, proteger o meio ambiente e combater as mudanças climáticas, além de gerar valor econômico significativo.
No entanto, a criação tradicional de bambu enfrenta desafios devido ao longo estágio de crescimento vegetativo e ao período de floração incerto. Embora técnicas de melhoramento molecular tenham sido desenvolvidas e aplicadas ao melhoramento do bambu, o processo de transformação do gene do bambu é demorado, trabalhoso e complicado devido aos processos de indução e regeneração do calo 2,3,4,5. A transformação genética estável frequentemente requer métodos mediados por Agrobacterium, que envolvem processos de cultura de tecidos, como indução e regeneração de calos. No entanto, o bambu tem uma baixa capacidade de regeneração de calos, limitando muito a aplicação de transformação genética estável no bambu. Depois que a Agrobacterium infecta as células vegetais, o fragmento de T-DNA entra nas células vegetais, com a maioria dos fragmentos de T-DNA permanecendo não integrada nas células, resultando em expressão transitória. Apenas uma pequena porção de fragmentos de T-DNA se integra aleatoriamente ao seu cromossomo, levando a uma expressão estável. Os níveis de expressão transitória mostram uma curva de acumulação que pode variar para cada gene expresso a partir de um T-DNA liberado por Agrobacterium. Na maioria dos casos, os níveis mais elevados de expressão ocorrem 3-4 dias após a infiltração e diminuem rapidamente após 5-6 dias 6,7. Estudos anteriores mostraram que mais de 1/3 das mutações em plantas editadas por genes obtidas sem pressão de seleção para resistência provêm da expressão transitória de CRISPR/Cas9, enquanto os restantes menos de 2/3% vêm da expressão estável após a integração do DNA no genoma8. Isso indica que a integração do T-DNA no genoma da planta não é necessária para a edição de genes. Além disso, a pressão de seleção para resistência inibe significativamente o crescimento de células não-transgênicas, afetando diretamente o processo de regeneração de explantes infectados. Portanto, usando a expressão transiente sem pressão de seleção para resistência em bambu, é possível obter expressão não integrada de genes exógenos e estudar a função gênica diretamente em órgãos vegetais. Assim, um método fácil e que economiza tempo pode ser desenvolvido para expressão e edição de genes exógenos em bambu9.
O método desenvolvido de expressão gênica exógena e edição gênica é caracterizado por sua simplicidade, custo-efetividade e ausência de equipamentos caros ou procedimentos complexos9. Neste método, o gene da violaxantina desepoxidase endógena de bambu (PeVDE) foi usado como repórter para a expressão gênica exógena sem pressão de seleção. Isso ocorre porque o PeVDE editado em folhas de bambu reduz a capacidade de fotoproteção sob alta luminosidade e demonstra uma diminuição no valor de têmpera não fotoquímica (NPQ), que pode ser detectado através de imagens de fluorescência da clorofila. Para demonstrar a eficácia desse método, outro gene endógeno de bambu, o gene da cinamoil-CoA redutase (PeCCR5)9, foi nocauteado usando esse sistema e gerou mutantes desse gene com sucesso. Esta técnica pode ser utilizada para a caracterização funcional de genes que possuem funções em folhas de bambu. Ao superexpressar esses genes transitoriamente em folhas de bambu, seus níveis de expressão podem ser aumentados, ou por edição de genes, sua expressão pode ser derrubada, permitindo o estudo dos níveis de expressão gênica a jusante, fenótipos foliares e conteúdo do produto. Isso fornece uma abordagem mais eficiente e viável para a pesquisa da função gênica em bambu. Esta técnica pode ser aplicada na caracterização funcional de genes que funcionam em folhas de bambu. Ao superexpressar esses genes transitoriamente em folhas de bambu, seus níveis de expressão podem ser aumentados, ou por edição de genes, sua expressão pode ser derrubada, permitindo o estudo dos níveis de expressão gênica a jusante, fenótipos foliares e conteúdo do produto. Além disso, é importante notar que, devido à poliploidização extensa, a maioria dos genes comercialmente importantes em genomas de bambu está presente em múltiplas cópias, resultando em redundância genética. Isso representa um desafio para a realização de edição do genoma multiplex em bambu. Antes da aplicação de técnicas de transformação genética estável ou edição de genes, é crucial validar rapidamente as funções do gene. Ao abordar a questão das cópias múltiplas de genes, uma abordagem é analisar perfis de expressão do transcriptoma para identificar genes que são ativamente expressos durante estágios específicos. Além disso, o direcionamento dos domínios funcionais conservados dessas cópias gênicas permite o planejamento de seqüências-alvo comuns ou a incorporação de múltiplos sítios alvo no mesmo vetor CRISPR/Cas9, permitindo o knockout simultâneo desses genes. Isso fornece uma abordagem mais eficiente e viável para a pesquisa da função gênica em bambu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35S::RUBY</td>
			<td>Addgene, United States</td>
			<td>160908</td>
			<td>Plamid construct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1</td>
			<td>Biomed, China</td>
			<td>BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01</td>
			<td>For Agrobacterium infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB</td>
			<td>Sigma-Aldrich, United States</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging-PAM fluorometer</td>
			<td>Walz, Effeltrich, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagingWin</td>
			<td>Walz, Effeltrich, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Software for Imaging-PAM fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paq CI or Aar I</td>
			<td>NEB, United States</td>
			<td>R0745S</td>
			<td>Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA polymerase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>R045Q</td>
			<td>For gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB, United States</td>
			<td>M0202V</td>
			<td>Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in planta gene expression and gene editing in moso bamboo leaves

Um novo método de transformação gênica em plantas foi desenvolvido para o bambu, o que evita a necessidade de processos demorados e trabalhosos de indução e regeneração de calos. Este método envolve a expressão gênica mediada por Agrobacterium via ferimento e vácuo para mudas de bambu. Demonstrou com sucesso a expressão de genes exógenos, como o RUBY reporter e o gene Cas9 , em folhas de bambu. A maior eficiência de transformação para o acúmulo de betalaína em mudas de RUBI foi obtida com o uso da linhagem GV3101, com percentual de 85,2% após a infecção. Embora o DNA estranho não tenha se integrado ao genoma do bambu, o método foi eficiente na expressão dos genes exógenos. Além disso, um sistema de edição genética também foi desenvolvido com um repórter nativo usando esse método, a partir do qual um mutante in situ gerado pelo gene editado da violaxantina desepoxidase de bambu (PeVDE) em folhas de bambu, com uma taxa de mutação de 17,33%. A mutação do PeVDE resultou na diminuição dos valores de têmpera não fotoquímica (NPQ) sob luz alta, que pode ser detectada com precisão por um fluorômetro. Isso torna o PeVDE editado um potencial repórter nativo para genes exógenos e endógenos em bambu. Com o repórter do PeVDE, um gene da cinamoil-CoA redutase foi editado com sucesso com uma taxa de mutação de 8,3%. Esta operação evita o processo de cultura de tecidos ou indução de calos, que é rápido e eficiente para expressar genes exógenos e edição de genes endógenos em bambu. Este método pode melhorar a eficiência da verificação da função gênica e ajudará a revelar os mecanismos moleculares das principais vias metabólicas no bambu.

The investigation of gene function in bamboo holds great promise for the advanced understanding of bamboo and unlocking its potential for genetic modification. An effective way of this can be achieved through the process of Agrobacterium-mediated infection in bamboo leaves, whereby the T-DNA fragment containing exogenous genes is introduced into the cells, subsequently leading to the expression of the genes within the leaf cells.
Bamboo is a valuable and renewable resource with a wide range of applications in manufacturing, art, and research. Bamboo possesses excellent wood properties such as high mechanical strength, toughness, moderate stiffness, and flexibility1, which is now widely used in a variety of household and industrial supplies, including toothbrushes, straws, buttons, disposable tableware, underground pipelines, and cooling tower fillers for thermal power generation. Therefore, bamboo breeding plays a crucial role in obtaining bamboo varieties with excellent wood properties for replacing plastics and reducing plastic usage, protecting the environment, and tackling climate change, as well as generating significant economic value.
However, traditional bamboo breeding faces challenges due to the lengthy vegetative growth stage and uncertain flowering period. Although molecular breeding techniques have been developed and applied to bamboo breeding, the process of bamboo gene transformation is time-consuming, labor-intensive, and complicated due to the callus induction and regeneration processes2,3,4,5. Stable genetic transformation often requires Agrobacterium-mediated methods, which involve tissue culture processes such as callus induction and regeneration. However, bamboo has a low ability for callus regeneration, greatly limiting the application of stable genetic transformation in bamboo. After Agrobacterium infects plant cells, the T-DNA fragment enters the plant cells, with the majority of T-DNA fragments remaining non-integrated in the cells, resulting in transient expression. Only a small portion of T-DNA fragments randomly integrate into its chromosome, leading to stable expression. The transient expression levels show an accumulation curve that can vary for each gene expressed from an Agrobacterium-delivered T-DNA. In most cases, the highest expression levels occur 3-4 days after infiltration and quickly decrease after 5-6 days6,7. Previous studies have shown that more than 1/3rd of mutations in gene-edited plants obtained without selection pressure for resistance come from the transient expression of CRISPR/Cas9, while the remaining less than 2/3rd come from stable expression after DNA integration into the genome8. This indicates that T-DNA integration into the plant genome is not necessary for gene editing. Moreover, selection pressure for resistance significantly inhibits the growth of non-transgenic cells, directly affecting the regeneration process of infected explants. Therefore, by using transient expression without selection pressure for resistance in bamboo, it is possible to achieve non-integrated expression of exogenous genes and study gene function directly in plant organs. Hence, an easy and time-saving method can be developed for exogenous gene expression and editing in bamboo9.
The developed exogenous gene expression and gene editing method is characterized by its simplicity, cost-effectiveness, and the absence of expensive equipment or complex procedures9. In this method, the bamboo endogenous violaxanthin de-epoxidase gene (PeVDE) was used as the reporter for exogenous gene expression without selection pressure. This is because the edited PeVDE in bamboo leaves reduces the photoprotection ability under high light and demonstrates a decrease in the non-photochemical quenching (NPQ) value, which can be detected through chlorophyll fluorescence imaging. To demonstrate the effectiveness of this method, another bamboo endogenous gene, the cinnamoyl-CoA reductase gene (PeCCR5)9, was knocked out using this system and successfully generated mutants of this gene. This technique can be used for the functional characterization of genes that have functions in bamboo leaves. By overexpressing these genes transiently in bamboo leaves, their expression levels can be enhanced, or by gene editing, their expression can be knocked down, allowing for the study of downstream gene expression levels, leaf phenotypes, and product contents. This provides a more efficient and feasible approach for gene function research in bamboo. This technique can be applied to the functional characterization of genes that function in bamboo leaves. By overexpressing these genes transiently in bamboo leaves, their expression levels can be enhanced, or by gene editing, their expression can be knocked down, allowing for the study of downstream gene expression levels, leaf phenotypes, and product contents. Additionally, it is important to note that, due to extensive polyploidization, the majority of commercially important genes in bamboo genomes are present in multiple copies, resulting in genetic redundancy. This poses a challenge for performing multiplex genome editing in bamboo. Prior to the application of stable genetic transformation or gene editing techniques, it is crucial to quickly validate gene functions. In addressing the issue of multiple gene copies, one approach is to analyze transcriptome expression profiles to identify genes that are actively expressed during specific stages. Furthermore, targeting the conserved functional domains of these gene copies allows for the design of common target sequences or the incorporation of multiple target sites into the same CRISPR/Cas9 vector, enabling the simultaneous knockout of these genes. This provides a more efficient and feasible approach for gene function research in bamboo.

Autor em destaque: Avançando na edição de genes em folhas de bambu para alternativas sustentáveis de plástico 

Em Planta Expressão Gênica e Edição Gênica em Folhas de Bambu Moso

In this study, we used Agrobacterium as a vector to introduce foreign DNA fragments into bamboo leaves. Most DNA fragments are not integrated into chromosomes and undergo transient expression. We took advantage of this transient expression to carry out gene editing.The main challenge is the limitation of gene editing of bamboo leaves, which cannot regenerate. This propose difficulties in performing editing in regenerative organs, like young shoots, and obtaining edited branches or subsequent generations with desired genetic challenges. Its main advantage is the time-saving aspect of the principle.By being able to edit bamboo genes directly in bamboo leaves, it allows for quick verification of gene fractions. This eliminates the needs for time-consuming procedures, like tissue culture or transformation, significantly speeding up research on bamboo gene fractions. The primary research will be focused on investigating the molecular mechanism of bamboo biomass formation.This will involve understanding why bamboo grows rapidly, and using that knowledge to develop bamboo varieties which are suitable for plastic substituent.

Expressão gênica mediada por agrobactérias em plantas em folhas de bambu O gene repórter RUBY demonstrou ser eficaz na visualização da expressão gênica transitória devido à sua capacidade de produzir betalaína vermelha vívida a partir da tirosina10. Neste estudo, a transformação mediada por Agrobacterium foi utilizada para expressar transitoriamente o gene exógeno RUBI em folhas de bambu (Figura 1<...

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Neste estudo, um novo método de expressão gênica e edição gênica mediado por Agrobacterium foi desenvolvido em bambu. Este método melhorou muito a eficiência da validação da função gênica em bambu, o que tem implicações significativas para acelerar o processo de criação de bambu.

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

Neste estudo, usamos Agrobacterium como vetor para introduzir fragmentos estranhos de DNA em folhas de bambu. A maioria dos fragmentos de DNA não está integrada aos cromossomos e sofre expressão transitória. Aproveitamos essa expressão transitória para realizar a edição gênica.O principal desafio é a limitação da edição genética das folhas de bambu, que não conseguem se regenerar. Isso propõe dificuldades em realizar edições em órgãos regenerativos, como brotos jovens, e obter ramos editados ou gerações subsequentes com desafios genéticos desejados. Sua principal vantagem é o aspecto de economia de tempo do princípio.Ao ser capaz de editar genes de bambu diretamente nas folhas de bambu, permite a verificação rápida de frações gênicas. Isso elimina a necessidade de procedimentos demorados, como cultura ou transformação de tecidos, acelerando significativamente a pesquisa sobre frações gênicas de bambu. A pesquisa primária será focada na investigação do mecanismo molecular de formação da biomassa do bambu.Isso envolverá entender por que o bambu cresce rapidamente e usar esse conhecimento para desenvolver variedades de bambu que sejam adequadas para substituintes de plástico.

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Research

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Biology

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

1.1K visualizações.  Key Laboratory of State Forestry and Grassland Administration/Beijing on Bamboo & Rattan Science and Technology. Neste estudo, usamos Agrobacterium como vetor para introduzir fragmentos estranhos de DNA em folhas de bambu. A maioria dos fragmentos de DNA não está integrada aos cromossomos e sofre expressão transitória. Aproveitamos essa expressão transitória para realizar a edição gênica.O principal desafio é a limitação da edição genética das folhas de bambu, que não conseguem se regenerar. Isso propõe dificuldades em realizar edições em órgãos regenerativos, como brotos jov...

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A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and regeneration processes. This method involves Agrobacterium-mediated gene expression via wounding and vacuum for bamboo seedlings. It successfully demonstrated the expression of exogenous genes, such as the RUBY reporter and Cas9 gene, in bamboo leaves. The highest transformation efficiency for the accumulation of betalain in RUBY seedlings was achieved using the GV3101 strain, with a percentage of 85.2% after infection. Although the foreign DNA did not integrate into the bamboo genome, the method was efficient in expressing the exogenous genes. Furthermore, a gene editing system has also been developed with a native reporter using this method, from which an in situ mutant generated by the edited bamboo violaxanthin de-epoxidase gene (PeVDE) in bamboo leaves, with a mutation rate of 17.33%. The mutation of PeVDE resulted in decreased non-photochemical quenching (NPQ) values under high light, which can be accurately detected by a fluorometer. This makes the edited PeVDE a potential native reporter for both exogenous and endogenous genes in bamboo. With the reporter of PeVDE, a cinnamoyl-CoA reductase gene was successfully edited with a mutation rate of 8.3%. This operation avoids the process of tissue culture or callus induction, which is quick and efficient for expressing exogenous genes and endogenous gene editing in bamboo. This method can improve the efficiency of gene function verification and will help reveal the molecular mechanisms of key metabolic pathways in bamboo.

In this study, a novel in planta gene expression and gene editing method mediated by Agrobacterium was developed in bamboo. This method greatly improved the efficiency of gene function validation in bamboo, which has significant implications for accelerating the process of bamboo breeding.

Biologia

Preparation of Bamboo Seedlings and Agrobacterium-Mediated In Planta Transformation System for Gene Expression

Preparation of Bamboo Seedlings and Agrobacterium -Mediated In Planta Transformation System for Gene Expression  

To begin, sow the pre-soaked bamboo seeds into the substrate of soil and vermiculite for germination. For agrobacterium infection, carefully remove the 15 day old seedlings with soil attached roots from the substrate. Wrap the seedlings with tinfoil to maintain moisture and prevent soil detachment.Transfer the wrapped seedlings to the plant growth chamber with higher humidity and lower illumination for two hours. Next, using a sharp needle from a syringe, wound the upper part of curled immature leaves once or twice. Quickly dip the wounded part of the leaves into agrobacterium suspension.Then immediately transfer the seedlings to a vacuum chamber with a pressure of 25 to 27 millimeters of mercury for two minutes. After vacuuming, carefully unwrap the seedlings and replant them into the substrate. Allow the seedlings to grow in a plant growth chamber in dim light with high humidity for two days.Then culture the seedlings under normal growth conditions, watering them every five to seven days.

Preparo de mudas de bambu e sistema de transformação mediado por agrobactérias em plantas para expressão gênica

In Planta Gene Expression and Measurement of Chlorophyll Fluorescence of Non-Photochemical Quenching Values in Bamboo Leaves

Begin by extracting the genomic DNA from the wild-type and Agrobacterium-infected bamboo leaves. Amplify the genomic DNA containing the target site of the target genes from wild-type and Agrobacterium-infected bamboo leaves using the following PCR conditions. After PCR, perform endonuclease enzyme digestion by preparing a reaction mixture containing one microliter of age-1, one microgram of PCR products, and five-microliter 10X buffer.Then, add water to a final volume of 50 microliters. Incubate the digestion mixture at 37 degrees Celsius for one hour. Using gel electrophoresis, analyze the proportion of digested DNA fragments.Compare the digested fragments from the wild-type and Agrobacterium-infected samples to assess gene editing efficiency. Expose the bamboo seedlings to high light intensity conditions to increase the amount of absorbed light quantum and activation of the leaf photoprotection system. Next, turn on the IMAGING-PAM fluorometer and set the actinic light intensity to measure in vivo photosystem II chlorophyll fluorescence of bamboo leaves.The red beta lane color produced by the RUBY gene indicated successful Agrobacterium-mediated gene expression in bamboo leaves. Out of the four Agrobacterium strains, GV3101 strain caused the most significant beta lane accumulation in infected bamboo leaves. After infection with the CRISPR-Cas9 constructs and high light treatments, certain areas of the leaf blades showed lower non-photochemical quenching values.Furthermore, enzyme digestion and sequencing analysis confirmed the successful mutation of the PeVDE gene in the edited regions. Sanger sequencing results of the PeVDE fragment after editing by both sgRNA1 and sgRNA2 showed deletion of a long fragment in the PeVDE gene. After 30 days of Agrobacterium infection, the leaf areas transfected with sgRNAs for both PeVDE and PeCCR5 exhibited lower non-photochemical quenching values.