As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares de seus autores e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Ministério do Exército ou do Departamento de Defesa. Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Whitney A. Greene, Alberto Muniz, e Ramesh R. Kaini realizou uma Pós-Investigação Associateship Conselho Nacional de Pesquisa da USAISR. Os ensaios foram realizados por Microarray Facility Cancer Research Institute Microarray Núcleo do Greehey Crianças e Bioinformática Departamento da UT Health Science Center San Antonio. Este trabalho foi apoiado pelo Exército dos EUA Programa de Clínica de Reabilitação Medicina Research (CRMRP) e Militar Programa de Pesquisa em Medicina Operacional (MOMRP).

1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura <ol><li> mídia mTeSR1: Preparar mídia mTeSR1 acordo com as instruções do fabricante. Descongelar 100 ml de suplemento mTeSR1 5x durante a noite a 4 ° C. Adicione os 100 ml de suplemento mTeSR1 5x para 400 ml de mTeSR1 mídia basais e misture bem. Este meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e à temperatura de -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Meios de diferenciação: Preparar meios de diferenciação em DMEM/F12 para produzir 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2,0 mM de L-glutamina, 10% de soro de knockout, e 10 ug / ml de gentamicina. </li><li> mídia iPS-EPR: Preparar mídia iPS-RPE em MEM, para se obter N1 1x suplemento, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, 13 ng / ml de sal de sódio tri-iodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina, e 15% de FBS 26. </li><li> Solução estoque de sal de sódio tri-iodo-L-tironina. Para preparar a solução-mãe de dissolver 1,0 mg de tri-iodo-L-tironinasal de sódio em 1 N de hidróxido de sódio rodando suavemente. Em seguida adicione 49,0 ml de meios de base para fazer 50,0 ml de 20 ug / ml de sal de sódio tri-iodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final. </li><li> Solução-mãe de hidrocortisona: Para preparar uma solução de estoque de hidrocortisona, solubilizar 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol absoluto com agitação suave. Em seguida adicione 19,0 ml de meios de base para 20 ml de solução de estoque de hidrocortisona de 50 ug / ml. aliquota e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final. </li><li> Meio de crescimento RPE Fetal. Preparar o meio de crescimento por mistura de todos os reagentes no kit RTEGM no meio basal, de acordo com as instruções do fabricante, com excepção para o FBS. </li><li> Fetal mídia RPE chapeamento. Prepare a mídia chapeamento por transferência de uma pequena quantidade de meio de crescimento para um recipiente estéril e umFBS DD para uma concentração final de 2%. </li><li> Dispase: Preparar a solução de trabalho de dispase de 1 mg / ml em DMEM/F12. </li><li> Placas revestidas com Matrigel: Preparar matrigel em DMEM/F12 de 0,08 mg / ml. </li><li> Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1,0 ml da solução de matrigel. </li><li> Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1,0 h. </li><li> Após a incubação de 1,0 hr, aspirar o excesso DMEM/F12. </li><li> Adicionar 0,5 ml de mídia mTeSR1 para evitar a secagem. As placas Matrigel revestido está agora pronto para o uso. </li></ol> 2. Cultura iPS <ol><li> Antes da semeadura de células iPS tem todos os tubos, quente mídia mTESR1 à temperatura ambiente, e as placas Matrigel revestido prontos. </li><li> Rapidamente descongelar os IMR90-4 células iPS em um C banho de água 37 °. Em seguida, remover o frasco de congelação do banho de água e esterilizar utilizando etanol a 70%. </li><li> Transferência das células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de agregados celulares. </li><li> Gota a gota, adicionar 5 ml de warm media mTeSR1 para as células e misture delicadamente. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender com cuidado os agregados celulares em 2 ml de mídia mTeSR1 e semear as células em um poço de uma placa de seis bem. </li><li> Colocar a placa num incubador e a cultura C 37 ° com 5% de CO 2, 95% de humidade. </li><li> Altere o meio de cultura de células iPS diária. Colônias indiferenciadas aparecerá 5-7 dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para a passagem (colônias com um centro denso). </li></ol> 3. Passaging de iPS Cells <ol><li> Antes de começar a passagem das células iPS, ter todos os tubos, solução dispase, mídia DMEM/F12 e mTERS1 aquecido à temperatura ambiente, eo matrigel placas revestidas pronto. </li><li> Antes passaging células iPS, remova quaisquer áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirando a mídia. Diferenciação deve permanecer abaixo de 20% do poço em altaculturas de qualidade. Lavar cuidadosamente o contendo células bem com 2 ml de DMEM/F12 iPS e adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM/F12 duas vezes. </li><li> Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de mTSER1 a cada poço. </li><li> Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar agregados. </li><li> Transfira as colônias isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar mídia mTeSR1 suficientes para semear a próxima passagem das células. </li></ol> 4. Diferenciação de células iPS para iPS-RPE <ol><li> Placa as células iPS para uma placa recém revestido em mídia mTESR1. </li><li> Permitir colônias de células iPS a se expandir por 4-5 dias em cultura. </li><li> Mídia mTeSR1 substituto com a mídia 4 ml diferenciação. Mude metade dos media a cada 3 dias. </li><li> Permitir focos pigmentadas para crescer o suficiente para ser dissecado manualmente fora da cultura (40-50 dias). </li><li> Use uma200 mL ponteira para cortar ao redor e levantar as colônias pigmentadas. </li><li> Coletar e reunir as colônias dissecados em um tubo cônico de 15 ml. </li><li> Em seguida, adicionam-se 5 ml de DMEM/F12 para as células de RPE reunidas e centrifugar a 300 xg durante 5 min, duas vezes. </li><li> Prepara-se uma solução de uma única célula, incubando a reunidas iPS-EPR com 0,25% de tripsina EDTA. </li><li> Lavar as células iPS-RPE com a mídia iPS-RPE e placa as células coletadas em um poço em 4 ml de mídia iPS-RPE revestido de matrigel fresco. </li><li> Cultura das células durante 3 semanas antes da passagem. Troque a mídia a cada 3 dias. Para o experimento, placas IPS-RPE em 100.000 células / cm 2. Coletar as células no dia 17. Conte o dia da semeadura como Dia 0. </li></ol> 5. Coleta de Amostras <ol><li> Coleção de células iPS <ol><li> Cultura as células iPS indiferenciadas até colônias são observados para ser denso no centro. </li><li> Lavar as colônias em DMEM/F12. </li><li> Dissociar-se em células individuais usando accutas<html> e. Recolher as células para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 2 ml de DMEM/F12. </li></ol></li><li> Coleção RPE Fetal <ol><li> Lavar culturas de células de RPE Fetal com DMEM/F12 e dissociar-se em células individuais usando 0,25% de tripsina EDTA. </li><li> Coletar as células em um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 2 ml de DMEM/F12. </li></ol></li><li> Coleção de células iPS-RPE <ol><li> Quando a IPS-RPE atingir passagem 3 e passagem 5, recolher as células no dia 17 após a passagem. Lavar iPS-RPE por duas vezes em PBS e preparar uma suspensão de células individuais por incubação com 1,0 ml de 0,25% de tripsina. </li><li> Neutralizar tripsina com 2 ml de gelo frio mídia iPS-RPE. </li><li> Recolher as células num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender a suspensão de células em 3 ml de tampão de coloração de kit de microesferas. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Negativa Seleção de iPS-RPE para remover as células indiferenciadas <ol><li> Manter todos os reagentes a 4 ° C até à sua utilização, mas não funcionam em gelo. Suspensão de células a partir do passo 5.3.4 Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de tampão de coloração de kit de microesferas por 2 x 10 6 células. </li><li> Adicionar 10 ul de anticorpo anti-TRA-1-60-PE por 2 x 10 6 células. </li><li> Misturar bem e incubar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar células em 1-2 ml de tampão por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Suspenda as células em 80 ul de tampão de coloração por 2 x 10 6 células. Adicionar 20 ul de microesferas anti-PE rotulados (do kit) por 2 x 10 6 células. Misture bem. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1-2 ml de tampão de coloração por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 500 &amp; #956; l de tampão de coloração. </li><li> Separação celular magnética: <ol><li> Colocar a coluna no seleccionador de células magnético. Lavar coluna com 3 ml de tampão de coloração. </li><li> Aplicar a suspensão de células a partir de 6,8 em coluna. </li><li> Colocar um tubo na porta negativa para recolher os TRA-1-60 células negativas. </li></ol></li></ol> 7. ARN total Extracção <ol><li> Lyse as células executando as amostras através de uma coluna de microcentrífuga homogeneizador mini-rotação disponível no mercado projetado para minipreps ácidos nucleicos. </li><li> Extrato de RNA total a partir de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal com o kit de extração de RNA disponível no mercado projetado para preservar as pequenas moléculas de RNA 27. </li><li> Determine as concentrações totais de RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop. </li></ol> 8. Bioanalyzer e Microarray Assay <ol><li> Verifique a integridade do RNA com Bioanalyzer em conjunto com o kit de qualidade RNA disponíveis comercialmente. </li><li> Incubar 100 ng deRNA total com fosfatase intestinal de vitelo a 37 ° C durante 30 min </li><li> Desnaturar o RNA utilizando 100% de DMSO a 100 ° C durante 5 min. </li><li> Rotular as amostras com PCP-Cy3 usando ligase T4 por incubação a 16 ° C durante 1 hora. </li><li> Hibridizar em um formato de matriz 8_x_15K miARN humano. </li><li> Lavar as matrizes de acordo com as instruções do fabricante e digitalizar a uma resolução de 5 mM usando um scanner. </li><li> Aquisição de dados usando o recurso de microarray software extração compatível com o microarray miRNA. </li><li> Processar os sinais miRNA para determinar o nível relativo de expressão em cada amostra. </li><li> Comparar os níveis de cada um miARN entre os grupos de amostra de expressão. Escolha miRNAs com expressão diferencial, pelo menos, duas vezes maior para posterior análise. </li><li> Usando um software disponível no mercado para análise de dados, siga as instruções para gerar mapas de calor para visualização de miRNAs diferencialmente expressos 28. </li></ol> 9. Análise Pathway <ol><li> Salve os dados dos miRNAs selecionados em 8,9 em formato Excel. </li><li> Faça o login no programa de análise de RNA via online. Faça o upload do arquivo do Excel. Selecione &quot;Format flexível&quot; para o formato de arquivo e selecione &quot;Agilent&quot; da lista drop-down para o tipo de identificador. </li><li> Sob rubrica de dados brutos, atribuir &quot;ID&quot; para sondar coluna ID e atribuir &quot;Observação 1&quot; e &quot;relação de log&quot; para a coluna de ração log. Selecione &quot;ignorar&quot; para todas as outras colunas. </li><li> Selecione os parâmetros para análise, conforme segue: Confiança: experimentalmente apenas observado; incluir as relações diretas e indiretas; e incluem produtos químicos endógenos; Seleccione a base de conhecimento Ingenuity como o conjunto de referência. Escolher a base de dados de referência de moléculas que inclui os dados de todas as espécies, todas as linhas de células e tecidos, e todas as mutações. </li><li> Rede Run e caminho analisa. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Em conclusão, este relatório descreve os métodos utilizados para a cultura de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal. RPE derivado do iPS são morfológica e funcionalmente similares ao RPE fetal. O iPS-RPE também expressa genes RPE característicos incluindo RPE65, CRALBP, PEDF e LRAT 16. Para melhor caracterizar estas células, o RNA foi extraído e utilizado para realizar a análise de microarray para identificar diferencialmente expressos miRNA. A análise das intensidades de sinal revelou que foi detectad...

As células estaminais têm a capacidade de se replicar sem limite e o potencial para se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. O desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes suscitou grande entusiasmo na comunidade científica e entre os médicos, como o advento da regeneração do tecido personalizado está no horizonte 1. Induzido por células-tronco pluripotentes (iPS) apresentam as mesmas características do potencial replicativo ilimitado e pluripotência como células-tronco embrionárias (ES), contornando os dilemas éticos associados à CES. Além disso, as células estaminais derivadas de pacientes não irão estimular uma resposta imune, aumentando grandemente a probabilidade de sucesso de 2-3 aplicações terapêuticas. Sob condições específicas de cultura, as células iPS foram mostrados para se diferenciar em vários tipos de células diferentes in vitro, incluindo os cardiomiócitos, neurónios, células beta pancreáticas, hepatócitos, e epitélio pigmentado da retina (RPE) 4-12. A EP é uma camada de células epiteliais especializadas pigmentadas localizadas na parte posterior da retina, que desempenha várias funções que são essenciais para a saúde visual e função, tais como a absorção de luz dispersa, a fagocitose dos segmentos externos de fotorreceptores, e processamento de retinóides para a produção de cromóforo visual. Disfunção do EPR devido a lesão ou doença afeta profundamente fotorreceptor saúde e função visual como evidenciado pelas doenças que causam cegueira que são o resultado de patologia RPE subjacente, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Tratamentos realmente eficazes que possam restaurar a visão não foram alcançados, e substituição de RPE doente com RPE saudável pode ser a melhor opção para evitar a perda de visão 14-15. RPE derivado iPS (IPS-RPE) é uma possível fonte de células para substituir o RPE danificadas. iPS-RPE expressa caracteproteínas RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; exibe a morfologia RPE hexagonal altamente pigmentada clássica; e executa funções tais como RPE fagocitose, processamento de retinóide, e secreção de 11 - 5,16 retina cis. No entanto, antes iPS-RPE pode ser usada terapeuticamente, o IPS-RPE deve ser completamente caracterizada. Compreender os factores que regulam a diferenciação EPR é necessário para melhorar o rendimento e a pureza das células a serem utilizadas para aplicações clínicas. Diferenciação de células é o resultado da expressão de genes altamente regulada. Remodelação epigenética do genoma e da coordenação dos fatores de transcrição são necessários para as decisões do destino da célula que ocorrem durante a diferenciação e desenvolvimento 17. Regulamento de mensagem de RNA (mRNA) Tradução por microRNA (miRNA) apresenta ainda um outro nível de regulação que afeta o destino da pilha 1. MiRNAs são curtos, ~ 22 nt, comprimentos de nucleotídeos que seja tradução suprimir porligação à extremidade 3 &#39;UTR do ARNm ou o ARNm alvo para degradação. MiRNAs foram detectados em praticamente todos os tecidos e até o momento mais de 2.000 microRNAs humanos únicos foram registrados no banco de dados miRBase. Desde miRNAs exigem complementaridade parcial de se ligar ao mRNA-alvo, num único miARN pode potencialmente se ligam a dezenas ou centenas de alvos, e vice-versa, isto é, um único mRNA pode ser alvo de várias miRNAs diferentes. Esta característica de ligação promíscua aumenta dramaticamente o nível de complexidade da regulamentação, bem como o nível de dificuldade de determinar as funções dos miRNAs individuais e do papel que cada um desempenha nas funções celulares 18-21. No entanto, estudos têm mostrado que miRNA refina expressão gênica durante a diferenciação por afetar o estado de metilação de DNA 17. Num estudo mais específico para o EPR, miR-204/211 foi mostrado para promover o fenótipo epitelial do RPE 22. Outro grupo analisado o perfil miRNAde RPE durante a diferenciação de células-tronco embrionárias e revelou conjuntos distintos de miRNA são expressos durante o processo de diferenciação 23. De facto, os perfis de miRNA pode distinguir inequivocamente os tipos de células, incluindo células embrionárias, células precursoras, e células terminalmente diferenciadas 24,25. Mais de 250 miRNAs são expressos na retina. Com base nesses estudos, a hipótese de que os miRNAs desempenham um papel importante durante a diferenciação de RPE de iPS. O objetivo deste relato é descrever os protocolos para a diferenciação de RPE de IMR90-4 células iPS, coleção de RNA para análise por microarray, e da análise de dados de microarrays para identificar os miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células, as células iPS , iPS-RPE e RPE fetal. O RNA total foi extraído a partir de culturas de cada tipo de célula e hibridado com uma micromatriz miARN, contendo sondas específicas para 1205 miRNAs humanos e 144 miRNAs virais. Os resultados de microarray foram comparard para determinar quais miRNAs foram diferencialmente expressos entre os diferentes tipos de células. miRNAs com 2 vezes ou mais alterações vezes na expressão foram seleccionadas para posterior análise. Um programa de software de análise de miARN foi usada para identificar potenciais alvos dos miRNAs expressos diferencialmente e para gerar redes celulares regulados por miRNAs seleccionados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

O objetivo deste relato é descrever os protocolos para comparar o microRNA (miRNA) perfis de humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE) e RPE fetal. Os protocolos incluem a recolha de RNA para análise de microarray, e a análise de dados de microarrays para identificar miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células. Os métodos para cultura de células iPS e RPE fetal são explicados. O protocolo utilizado para a diferenciação de RPE de iPS humana também é descrito. A técnica de extracção de RNA descrevemos foi seleccionado para permitir a recuperação máxima de ARN muito pequena para ser utilizado em um microarray miARN. Finalmente, via celular e análise de redes de dados microarray é explicado. Estas técnicas vão facilitar a comparação dos perfis de miRNA de três tipos de células diferentes.

células iPS (Figura 1A) foram cultivadas em condições de diferenciação para induzir a diferenciação em células iPS-RPE. O iPS-RPE exibiu clássico fenótipo de RPE hexagonal morfologia das células pigmentadas (Figura 1B), semelhante ao RPE fetal (Figura 1C). Para entender melhor o papel que pode desempenhar miRNA durante o processo de diferenciação de iPS a iPS-EPR, análise de microarray de expressão miRNA foi conduzido. O RNA t...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K visualizações.  JBSA Fort Sam Houston.  O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados. 

Vídeo: MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Biologia

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Modelando e analisando a degeneração da retina

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Autor em destaque: Desvendando a patogênese da degeneração macular relacionada à idade e descobrindo possíveis terapias 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.