O protocolo é significativo, pois mostra o isolamento e transfecção de células epiteliais pigmentares de cinco mamíferos como um sistema ideal para estudar a terapia genética ocular em várias configurações. A principal vantagem deste método é sua flexibilidade, transferência, alto rendimento celular, viabilidade e taxa de transfecção devido às cinco espécies e ao sistema transposon SB100X não viral utilizado. Essas técnicas foram desenvolvidas para estudar abordagens de terapia genética direcionadas às células epiteliais de pigmento da retina e íris, isoladas e transfetificadas no protocolo atual, mas são utilizáveis para qualquer pesquisa ocular.
Demonstrando o procedimento estará Gregg Sealy, um técnico do laboratório. Depois de eutanásia do animal, use tesouras curvas e fórceps colibri para enuclear os olhos e, em seguida, limpar o tecido muscular restante e a pele dos olhos. Colete os olhos em um tubo de 50 mililitros cheio de PBS não estérei e transfira o tubo para a coifa de fluxo laminar.
Desinfetá-los submergindo em solução à base de iodo por dois minutos, em seguida, transfira os olhos para um tubo de 50 mililitros cheio de PBS estéril. Coloque um olho em uma compressa de gaze estéril e segure firmemente o olho perto do nervo óptico. Em seguida, corte perto do limite da íris com um bisturi número 11.
Usando uma tesoura, corte ao redor da íris e remova o segmento anterior e coloque-o em uma placa de Petri, deixando a lâmpada com o vítreo até que o pigmento da retina epitelial, ou células RPE, sejam isolados. Para isolar o pigmento de íris, ou células IPE, remova a lente com fórceps finos e retire delicadamente a íris que contém as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri e lave-a com PBS estéril.
Adicione 500 microliters de 0,25% de trippsina e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Retire a trippsina, adicione 500 microliters de meio completo e raspe o IPE delicadamente com uma pipeta Pasteur plana e polida em fogo. Pegue a suspensão do celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.
Conte as células usando a câmara de Neubauer, e sementes 0,2 milhões de células por poço em uma placa de 24 poços com um mililitro de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e culta-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para isolar as células RPE, remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com fórceps finos.
Coloque as lâmpadas na placa de 24 poços e adicione 500 microliters de 0,25% trypsin por olho e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Remova a trippsina, adicione 500 microliters de meio por globo completos e raspe as células RPE delicadamente com uma pipeta Pasteur curva, polida pelo fogo. Pegue a suspensão do celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.
Conte as células usando a câmara de Neubauer e semee as células como descrito anteriormente. Coloque a placa na incubadora. Limpe o tecido muscular e a pele restantes dos olhos e desinfete os olhos em solução à base de iodo e enxágue-os com PBS.
Para isolar as células IPE, remova a lente e puxe a íris como descrito anteriormente. Depois de preparar duas íris, adicione um mililitro de meio completo e isole as células coçando com uma pipeta Pasteur plana e polida em fogo, em seguida, conte e semee as células. Coloque a placa na incubadora.
Para isolar as células RPE, remova o vítreo e a retina do segmento posterior e coloque a lâmpada em uma placa de Petri. Encha a lâmpada com um mililitro completo. Usando uma pipeta Pasteur curva, polida em fogo, remova as células RPE.
Colete a suspensão celular dentro da lâmpada usando uma pipeta de 1.000 microliter e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro para resuspensão. Em seguida, conte e semee as células e incubar a placa como demonstrado anteriormente. Após a limpeza, abra o olho e corte ao redor da íris para remover o segmento anterior, em seguida, coloque em uma placa de Petri.
Deixe a lâmpada com o vítreo até que as células RPE estejam isoladas. Para isolar as células IPE, se a lente vier com o segmento anterior, remova a lente e use fórceps finos para retirar delicadamente a íris que contém as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri e lave-a com PBS estéril.
Corte o corpo ciliar com um bisturi número 10. Depois de preparar as íris, incuba-as com dois mililitros de 0,25% de trippsina a 37 graus Celsius por 10 minutos. Remova a trippsina e adicione dois mililitros de meio completo, em seguida, isole as células coçando com uma pipeta Pasteur plana e polida.
Transfira a suspensão celular para um tubo de dois mililitros e centrifugar as células por 10 minutos a 120 vezes G.Descarte o sobrenante e resuspenque as células em dois mililitros de meio completo. Semente 0,32 milhões de células por poço em uma placa de seis poços em três mililitros de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e culta-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para isolar as células RPE, remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com fórceps. Evite danificar o pigmento da retina epitélio. Lave a lâmpada com PBS.
Depois de preparar ambos os olhos, encha a lâmpada cerca de três quartos cheio com trippsina, e incubar por 25 minutos a 37 graus Celsius com a tampa da placa de Petri em cima do olho da lâmpada. Remova a trippsina e adicione um mililitro de meio completo. Usando uma pipeta Pasteur curva, polida em fogo, remova as células RPE.
Colete a suspensão celular dentro da lâmpada e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro para a ressuspensão. Centrifugar as células por 10 minutos a 120 vezes G.Seed 0,32 milhões de células por poço em uma placa de seis poços em três mililitros de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e culta-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Cultume as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Depois de três a quatro dias, pipeta para cima e para baixo para coletar células não aadeentes e colocar metade do volume em outro poço. Encha o poço a um mililitro com meio completo.
Depois de mais três a quatro dias, repita a coleção celular, desta vez agrupando as células não aadeentes de dois poços em um. Adicione meio a todos os poços. Observe as células e troque o meio duas vezes por semana.
Quando as células atingirem a confluência, mude para meio completo com 1%FBS. Utilizando os protocolos acima mencionados, as células IPE e RPE foram isoladas com sucesso e cultivadas a partir de cinco espécies diferentes. O padrão de expressão RPE foi confirmado em células de IPE bovina primária por imunofluorescência para RPE65.
A viabilidade celular foi estudada para excluir uma toxicidade potencial do tampão de eletroporação usando um kit de ensaio de citotoxicidade comercialmente disponível e um controle eletroporado de nós. Não foi observado impacto na viabilidade celular. Células epiteliais de pigmento pré-cultivadas de diferentes espécies foram transfeinadas com a proteína amarela fluorescente de Vênus.
As células RPE19 transfectadas foram utilizadas como controle positivo. A quantificação da eficiência de transfecção em RPE de suínos pré-esculpidos é mostrada aqui. Células epiteliais de pigmento de coelho recém-isoladas foram transfeinadas com a proteína fluorescente amarela Vênus e foram monitoradas por microscopia.
As células epiteliais pigmentadas foram transfeinadas com fator derivado do epitélio pigmento e a secreção proteica foi monitorada pela mancha ocidental. O sinal para células transfeinadas foi maior em comparação com células não transfectadas para todas as espécies e dias estudados, e não foi observada diminuição na secreção proteica dentro deste período. É crucial evitar raspar as células com ferramentas afiadas.
Aqui, pipetas Pasteur polidas com fogo são usadas, exceto em pequenos olhos de rato, onde um bisturi redondo deve ser usado. Células epiteliais pigmentares podem ser usadas para desenvolver abordagens de terapia genética e simular condições patológicas, por exemplo, danos ao estresse oxidativo. Esses modelos também podem ser usados para testar drogas terapêuticas.
