Este protocolo delineará uma maneira fácil e eficiente de isolar com sucesso células de epitélio pigmentada da retina primária do camundongo. As células de epitélio pigmentadas da retina desempenham um papel muito importante para manter as células fotorreceptoras e para garantir a função normal da retina. Nosso laboratório tem isolado células de epitélio pigmentadas do camundongo primário como uma ferramenta importante para estudar a barreira sanguínea externa e doenças relacionadas, como a degeneração macular relacionada à idade.
Para extrair os olhos do rato, eutanize eticamente o mouse de acordo com os métodos aprovados pela sua instituição, em seguida, coloque o rato em um subpad estéril e nuclear o olho pressionando uma pinça estilo 5/45 na área orbital para induzir proptose, em seguida, mova a pinça para o posterior do olho e puxe suavemente para remover o olho garantindo que o nervo óptico ainda esteja intacto. Ao usar fórceps, submersa os olhos em um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo iodo povidone de 5%. Incubar os olhos à temperatura ambiente por 2 a 3 minutos.
Retire os olhos do iodo povidone e coloque-os em uma placa de Petri. Enquanto usa uma pipeta de transferência estéril, lave os olhos com a Solução Salina Balanceada hanks até que a cor laranja do iodo povidone se foi. Isso leva aproximadamente 2 a 3 lavagens.
Coloque os olhos em uma nova placa de Petri e submerse-os em mídia de crescimento de células RPE completas a frio. A partir daí, você pode começar a dissecar sob um microscópio dissecando. Sob o microscópio, use pinças e/ou tesouras Vannas para puxar ou cortar tecido conjuntivo em músculos extraoculares.
Os olhos podem então ser mantidos por uma hora em mídia de cultura celular RPE fria. No entanto, é preferível proceder diretamente para o próximo passo após a limpeza do globo ocular. Transfira os olhos para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo a solução enzima A e, em seguida, incubar os olhos dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius por 40 minutos.
Remova os olhos da enzima Uma solução e coloque-os em um novo tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo a solução enzimácica B, em seguida, coloque-os dentro de uma incubadora e incubar a 37 graus Celsius por 50 minutos. Remova os olhos da enzima B e coloque-os em uma placa de Petri de 60 milímetros e submerse-os e complete a mídia de crescimento celular RPE, em seguida, incubar os olhos a 4 graus Celsius por 30 minutos. Coloque o prato sob o microscópio de dissecação e comece a dissecar.
Use fórceps M5S e uma agulha de uma seringa para fazer uma incisão na seção ora seratta. Agora com dois fórceps, segure a parte interna da incisão com um pedórnio e segure a córnea com a outra força. Comece a arrancar lentamente a córnea da retina puxando a córnea.
Certifique-se de rasgar em pequenos incrementos e mover para baixo a lágrima como você remover a córnea. Isso garantirá que o RPE permanecerá praticamente intacto e você terá uma lágrima mais limpa. Uma vez que a córnea esteja completamente desapegada, você deve ser capaz de ver a íris e a lente.
Remova a íris e a lente com fórceps para manter a pureza do isolamento. Para remover a retina neural da camada RPE, segure a camada externa da tole com uma pinça e posicione um braço de uma segunda pinça entre o RPE e as camadas neurais. A partir daí, puxe suavemente ou retire a retina neural da camada RPE, em seguida, descarte a retina neural.
Mova a camada RPE para um lugar diferente no prato livre de detritos. Para separar o RPE do choroide e da esclera, raspe suavemente o interior da pálpebra com uma pinça no estilo 5/45 para garantir a separação das células RPE. As células RPE aparecem nubladas quando suspensas e completas mídias de crescimento celular RPE.
Aspire as células usando uma pipeta de transferência estéril de 3,2 mililitros e transfira para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo uma mídia completa de crescimento celular RPE. As células podem ser centrifugadas a 300g por 10 minutos à temperatura ambiente. Você pode então aspirar o supernaspe e resuspensar a pelota em mídia de crescimento de células RPE aquecidas.
Coloque as células em uma placa de Petri de 100 milímetros e incubar a 37 graus Celsius e 5%de CO2. Essas imagens mostram um isolamento bem sucedido na passagem 0 e na passagem 1, o que é evidente pela pigmentação das células RPE. Na passagem 4, as células se tornam menos características e exibem menos pigmento, mostram uma aparência semelhante ao fuso ou tornam-se mais robustas com uma área de superfície maior.
Validamos as células RPE com um marcador específico de RPE, RPE65 e uma proteína citoesquelético F-actin. Também verificamos se há contaminação potencial com células Muller por coloração com um marcador específico de células Muller, vimentina. Este protocolo é uma adaptação simplificada dos protocolos existentes.
O protocolo utiliza materiais e equipamentos associados que estão disponíveis na maioria dos laboratórios de pesquisa, o que ajudará a isolar as células RPE do rato primário de forma eficaz.
